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乳腺癌BRCA1-mRNA 表达及启动子区甲基化状态与临床病理特征的相关性

2019-01-19李晓锋汪园园刘希

实用医学杂志 2018年24期
关键词:组织学甲基化病理

李晓锋 汪园园 刘希

西安交通大学第一附属医院病理科(西安710061)

乳腺癌是指发生于乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤,随着近些年居民生活方式和饮食结构的改变,乳腺的发病率呈现逐年递增趋势。临床数据显示,全球乳腺癌年新增例数由1980年的64.1 万增长到2010年的164.3 万,年均增长率高达3.1%。我国乳腺癌发病率也处于持续增长状态,过去30年内几乎增长1 倍,且城市女性乳腺癌病死率升幅高于农村女性。随着乳腺癌患病率不断攀升,临床研究者们加强了对病理机理的研究,以往的研究主要集中在雌激素、孕激素和原癌基因对乳腺癌病理特征的影响方面。近年来,人们发现乳腺癌BRCA1是一种能够对损坏的DNA 进行修复的基因片段,在调控细胞周期、DNA 修复中发挥重要作用。甲基化是调节机体基因表达与关闭的重要过程,目前已经证实启动子甲基化与乳腺癌的发生存在密切联系。而本文则主要研究BRCA1 及启动子区甲基化状态对乳腺癌患者病理特征间的关系[1-2],现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年2月至2018年2月于西安交通大学第一附属医院经病理活检确诊为乳腺癌的350例患者为实验组,另选取50例同期于我院进行体检的健康女性为对照组,实验组350 例患者中年龄35~59 岁,平均年龄(46.21±2.68)岁,59 例为小管癌,64 例为鳞状细胞癌,49 例为浸润性小叶癌,82 例为浸润性导管癌,51 例为髓样癌,45 例为腺癌,组织学分级Ⅰ级80 例,Ⅱ期90 例,Ⅲ期90 例,Ⅳ期90 例,对照组50 例患者中年龄35~60 岁,平均(45.26±3.08)岁,两组研究对象一般资料如年龄、体质量、是否停经等资料对比差异不具有统计学意义(P>0.05),具有可比性。

纳入标准:(1)实验组患者均经病理学活检确诊为乳腺癌;(2)患者意识清晰能够配合进行调研;(3)病历资料齐全;(4)患者对本次调研过程方法、原理、过程清楚明白并签署知情同意书。排除标准:(1)合并精神疾患者;(2)合并其他器质性疾病如冠心病、肾衰竭等;(3)合并严重肝肾功能障碍者;(4)合并其他恶性肿瘤者;(5)依从性差者。

1.2 方法

1.2.1 乳腺癌易感基因1-mRNA(BRCA1-mRNA)水平测定 采取所有入选对象空腹静脉血5 mL,加入抗凝剂混匀后,置于离心机上,3 000 r∕min 速率进行离心,取上层清液,加入TRIzol LS 试剂,混匀后放于-80 ℃环境中储存,待所有入选对象血样采集齐全后统一进行BRCA1-mRNA 水平测定;取1 mL 含有TRIzol LS 的血清,加入200 μL 氯仿,混匀后冰水浴,于4 ℃条件下高速离心9 min,取上层清液,加入异丙醇、醋酸钠及糖原,于-20 ℃条件下静置60 min,而后取出高速离心,去除上层清液,加入75%乙醇充分混匀,高速离心,去除上层清液,60 ℃条件下静置晾干,加入纯水混匀,高速离心,而后于60 ℃条件下静置10 min,加入适量缓冲液及酶,微微振荡,离心,于37 ℃条件下静置30 min,加入DNA酶抑制剂,高速离心后,吸取上层清液,而后采取荧光定量聚合酶链反应检测BRCA1-mRNA水平。

1.2.2 启动子区甲基化状态测定 采取所有入选对象空腹静脉血5 mL,加入抗凝剂混匀后,置于离心机上,3 000 r∕min 速率进行离心,取上层清液,加入DNA 抽提缓冲液,混匀后于50 ℃条件下水浴1 h,而后加入蛋白酶K,于50 ℃条件下水浴12 h,加入等体积饱和酚,充分混匀,高速离心10 min,取上层清液,使用氯仿-异戊醇溶液抽提1 次,而后加入2 倍体积的无水冰乙醇进行DNA沉淀,滤出沉淀DNA,使用70%乙醇清洗3 次,室温干燥,加入适量TE 溶液,于-20 ℃条件下保存;取2~5 μg DNA 加入双蒸水至50 μL,而后加入氢氧化钠,于50 ℃条件下反应20 min,加入30 μL 10 mmol∕L 的对苯二酚与520 μL 3.6 mol∕L 亚硫酸氢钠,于54 ℃条件下反应16 h,而后进行DNA 纯化,纯化后的DNA 加入50 μL 80 ℃的双蒸水,加入3 μL 的氢氧化钠对DNA 进行修饰,经亚硫酸氢钠修饰的DNA 使用无水乙醇和糖原进行沉淀处理,而后干燥置于-40 ℃条件下保存;取处理得到的修饰DNA 使用甲基化特异性PCR 法检测启动子区甲基化阳性状态;

1.3 观察指标及评测标准 观察指标即为实验组与对照组BRCA1-mRNA 水平与其启动子区甲基化状态,记录后进行对比分析;

1.4 统计学方法 使用SPSS 22.0对采集的数据实施分析,计量资料以的形式表示,数据使用正态分布进行检验,示符合正态分布,组间差异使用单因素方差进行分析统计,相关性分析采用双变量直线相关分析,取P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组BRCA1-mRNA 水平与启动子区甲基化状态对比 经评测记录,发现实验组患者BRCA1-mRNA 水平低于对照组,启动子区甲基化阳性状态比率显著高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 两组BRCA1-mRNA 水平与启动子区甲基化状态对比Tab.1 Two groups of brca1-mrna level compared with the promoter region methylation status±s

表1 两组BRCA1-mRNA 水平与启动子区甲基化状态对比Tab.1 Two groups of brca1-mrna level compared with the promoter region methylation status±s

组别实验组对照组t 值P 值例数350 50--BRCA1-mRNA 水平(102 copy∕mL)1.69±0.05 5.26±0.16 3.264<0.05启动子区甲基化阳性[例(%)]261(74.57)7(14.00)2.514<0.05

2.2 BRCA1-mRNA 水平与临床病理相关性 经测量分析,实验组患者BRCA1-mRNA 水平与其年龄、TNM 分期、组织学分级不存在相关性,但与肿瘤大小存在相关性(r=-0.016,P<0.05),见表2。

2.3 启动子区甲基化与临床病理相关性 经测量对比,启动子区甲基化状态与患者年龄、TNM 分期、肿瘤大小无显著相关性,但与组织学分级存在相关性(r=0.681,P<0.05),见表3。

表2 BRCA1-mRNA 水平与临床病理相关性Tab.2 BRCA1-mRNA level and clinical pathologic correlation ±s

表2 BRCA1-mRNA 水平与临床病理相关性Tab.2 BRCA1-mRNA level and clinical pathologic correlation ±s

病历资料年龄≥50 岁<50 岁组织学分级例数BRCA1-mRNA 水平(102 copy∕mL)P 值210 140 1.33±0.15 1.64±0.06 0.681ⅠⅡⅢⅣ80 90 90 90 1.93±0.16 1.89±0.08 1.69±0.18 1.53±0.28 0.721 TNMⅠⅡⅢ129 150 71 1.86±0.15 1.78±0.28 1.54±0.18 0.985肿瘤大小≥5 cm<5 cm 200 150 1.21±0.06 1.68±0.38 0.051

表3 启动子区甲基化与临床病理相关性Tab.3 The promoter region methylation and clinical pathologic correlation

3 讨论

乳腺癌是女性较为常见的恶性肿瘤之一[3],其发病机制为乳腺上皮细胞在内外界因素刺激下,发生基因突变进而出现异常增殖,发生无序、无限制恶性增生[4],其主要表现形式为癌细胞出现异常增殖,进而破坏周围正常组织,改变乳腺正常结构。乳腺癌好发于40~60 岁之间,绝经期前后女性乳腺癌发病率较高,临床研究显示,乳腺癌的发病原因包括遗传、电离辐射、不健康饮食等,随着近些年我国工业化的推进和居民生活方式的改变,乳腺癌的发病率呈现逐年递增趋势,乳腺癌的主要临床表现包括乳房肿块、乳腺疼痛、腋窝淋巴结肿大等,由于该症发病初期症状并不明显,导致女性患者额对病情不甚重视,因而其病死率较高[5-8]。早期诊断和治疗对乳腺癌预后具有极为重要的意义,近些年,随着对乳腺癌分子生物学研究的深入,基因层次实验室诊断方式成为判断乳腺癌病情的重要手段之一。

BRCA1 是于1990年被发现的、与乳腺癌遗传性直接相关联的基因片段,该基因位于人体第17号染色体上,临床研究证实,该基因能够表达出抑制恶性肿瘤发生的效果,其主要功效为修复损坏的DNA、调节人体细胞复制、参与人体细胞生长等,如果机体BRCA1 基因片段出现损坏,其表现的抑癌功效就会减弱。学者解云涛通过研究指出,BRCA1 基因突变与家族性乳腺癌关系较为密切,该学者指出,白种人患有家族性乳腺癌患者中,约有15%~20%出现BRCA1 基因突变,而年龄高于70 岁人群如出现BRCA1 基因突变,则其发生乳腺癌的概率高达60%~80%;有学者的研究指出,国内家族性乳腺癌患者中约有12.9%出现了BRCA1 基因突变,而北京大学通过对409 例患有家族性乳腺癌患者进行检测的方式也发现,有10.5%的患者出现了BRCA1 基因突变,以上研究均提示,BRCA1 基因突变是乳腺癌发生的重要危险因素。

甲基化是蛋白质和核酸的一种重要修饰手段,其主要作用为调节基因的表达、关闭,近些年的研究指出,基因片段的甲基化与癌症、老年痴呆等症的发生具有密切联系[9-11],机体中甲基化最常见的修饰类型分为DNA 甲基化与组蛋白甲基化,其中DNA 甲基化的作用为关闭基因表达,多项临床研究证实,BRCA1 启动子甲基化与乳腺癌的发生及病情发展存在较为密切的联。学者刘韬等通过对198 例散发行乳腺癌患者与27 例乳腺纤维腺瘤进行对比分析的方式发现,乳腺癌组织中启动子区甲基化状态明显高于乳腺良性病变患者,同时分析可发现启动子区甲基化状态与患者DNA 甲基转移酶3A 表达成正相关,该学者分析认为,启动子区甲基化使BRCA1 蛋白表达水平降低,减弱了机体抑癌功能,从而增加了乳腺癌的发病率;有学者也通过研究发现,乳腺癌组织标本中BRCA1甲基化频率明显高于癌旁组织(24.5%vs. 7.5%),该学者认为通过对BRCA1 甲基化的检测,能够对乳腺癌的病情发展及预后进行判断。

通过设立实验组与对照组的方式,就乳腺癌BRCA1-mRNA 表达及启动子区甲基化状态与乳腺癌临床病理特征之间的相关性进行了探究[12-14]。从表1可以看出,乳腺癌患者BRCA1-mRNA 表达显著低于对照组,甲基化阳性状态比率显著高于对照组;同时经相关性分析显示,BRCA1-mRNA 水平与其年龄、TNM 分期、组织学分级不存在相关性,但与肿瘤大小存在相关性。而从表3的结果发现,启动子区甲基化状态与患者年龄、TNM 分期、肿瘤大小无显著相关性,但与组织学分级存在相关性。由此推测,BRCA1-mRNA 的低表达与启动子区甲基化之间存在一定关联性,随着乳腺癌患者病情的加重,其BRCA1-mRNA 的表达程度并未出现明显波动,提示BRCA1-mRNA 在检测乳腺癌中具有较高的准确率,而多项临床研究均指出,BRCA2 基因与乳腺癌的发病也存在较为密切联系,且BRCA2-mRNA 水平与组织学分期存在相关性,提示BRCA2-mRNA 可以作为乳腺癌分期的参考指标;本文的研究发现,即使健康女性中也存在部分启动子区甲基化状态,且随着乳腺癌患者组织学分期的加重,甲基化状态比率逐渐上升,这提示一方面启动子甲基化参与了乳腺癌早期病变,另一方面启动子甲基化状态也与乳腺癌的病情发展存在关联,有学者通过单中心、大样本研究指出,BRCA1 基因甲基化与其临床病理之间存在正相关联系[15],同时通过对BRCA1 基因甲基化状态的测定能够对乳腺癌患者预后进行判断。本次实验的特点是将BRCAI 水平和该基因甲基化作为两个独立的影响因素进行分析,探究其对乳腺癌患者病理特征的影响,能够为以后临床乳腺癌的诊断治疗提供指导[16-17]。

总之,乳腺癌BRCA1-mRNA 表达与乳腺癌患者病灶大小存在相关性,启动子区甲基化状态与乳腺癌患者组织学分期存在相关性,可以通过对这两项数据的检测来达到判断乳腺癌患者病情的效果。

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