胸腺素β4对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用

张忠胜 刘双凤 黄四春

清远市人民医院∕广州医科大学附属第六医院神经内科（广东清远511518）

急性脑梗死约占所有脑卒中类型的80%，具有高发病率、高致残率和高致死率的特点。脑缺血发生后，脑组织氧化损伤及神经细胞凋亡增加。胸腺素β4（thymosin β4，Tβ4）是由43 个氨基酸残基组成的多肽，具有促进干细胞分化，增强细胞增殖、迁移，抗凋亡，促进血管生成等多种生物学功能，与组织再生、血管生成和创伤愈合密切相关［1-3］。多个研究提示Tβ4 具有神经保护作用，能增加脊髓损伤大鼠神经元和少突胶质细胞数量，降低促炎细胞因子基因表达［4］，改善脑缺血大鼠的神经损伤症状［5］，有效抑制体外氧糖剥夺∕复糖复氧诱导的神经细胞凋亡和自噬［6］。而Tβ4 对局灶性缺血再灌注损伤SD 大鼠的氧化损伤和神经元凋亡作用仍不清楚。本研究采用改良线栓法制作大鼠大脑中动脉阻塞缺血再灌注模型，应用腹腔注射Tβ4，探讨Tβ4 对脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂 Tβ4 重组蛋白购自CLOUDCLONE CORP（USA）。脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNNEL）凋亡检测试剂盒购自碧云天生物公司（中国）。2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）Stain kit、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。其余试剂为国产分析纯。

1.1.2 仪器 倒置显微镜（XDZ-103CED），上海领成生物科技有限公司产品；L6 紫外分光光度计，上海精密科学仪器有限公司产品；DNM-9602G 酶标仪分析仪，北京普朗新技术有限公司产品。

1.1.3 动物 清洁级健康雄性SD 大鼠（体质量250～300 g，7～8 周龄）购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK（沪）20130016。

1.2 研究方法

1.2.1 动物分组与建模 所有SD 大鼠均于室温下正常喂养。根据随机数字表法将48 只SD 大鼠随机分为3组：假手术组（Sham组）、缺血再灌注组（I∕R组）和Tβ4 干预组（Tβ4组），每组16 只。Sham组大鼠颈内动脉仅被隔离，不栓塞大脑中动脉，然后缝合切口。模型制备参考改良Zea-Longa 线栓法［7］，I∕R组和Tβ4组大鼠予尼龙线栓塞大脑中动脉2 h 后复通。Tβ4组大鼠在大脑中动脉阻塞前后各1 h 分别腹腔注射Tβ4（8 μg∕kg）［8］，Sham组和I∕R组大鼠腹腔注射等量生理盐水。

1.2.2 Longa 评分法进行神经功能评分［7］各组大鼠均在脑缺血再灌注24 h 后进行神经功能评分。0 分：没有神经损伤的症状；1 分：不能完全伸展对侧前爪；2 分：大鼠向对侧转圈；3 分：向对侧倾倒；4 分：不能自行行走，失去意识。分数越高表明神经功能障碍越严重。只有评分在1～3 分的大鼠被纳入后续实验。

1.2.3 TTC 染色法测定各组大鼠脑梗死体积 将实验大鼠断头取脑并用盐水洗涤脑组织，然后将脑组织在-20 ℃冷冻20 min，收集2 mm 厚度的脑组织冠状切片，并立即将切片在含有2%TTC 的PBS缓冲液中培养，37 ℃避光孵育30 min，随后在4%甲醛溶液中固定24 h。取出固定好的脑片，将标本按组排列拍照，脑片中白色部分为梗死脑组织，采用Image-proplus 6.0 软件测量并计算脑切片梗死体积及与总体积的百分比。

1.2.4 TUNEL 法检测缺血区神经元凋亡情况 按照试剂盒说明书进行操作，石蜡切片脱蜡、烘片、乙醇水合，二氨基联苯胺镜下显色、水洗、苏木素复染。甘油封片后荧光显微镜下观察，从每个切片的缺血半暗带区域中随机选取5 个视野，采用图像分析软件计算相应区域TUNEL 阳性细胞。正常细胞核为蓝色荧光，凋亡细胞核为绿色荧光。计算细胞凋亡指数=凋亡细胞数∕总细胞数×100%。

1.2.5 化学比色法检测MDA 含量和SOD、GSHPx 活性 于缺血2 h 再灌注24 h 后处死大鼠，断头，取出缺血再灌注侧脑组织，冲洗干净后称重。用生理盐水预冷，制备脑组织匀浆液（10%），离心（4 000 r∕min，10 min）后取上清，采用化学比色法检测脑组织MDA 含量和GSH-Px、SOD 活性，相关具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.3 统计学方法 用SPSS 17.0 软件进行统计分析。计量资料用x±s表示，多组间均数比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 缺血2 h 再灌注24 h 后各组大鼠神经功能评分比较 造模前3组大鼠Longa 评分均为0，表明3组大鼠基线相同。缺血2 h 再灌注24 h 后，I∕R组Longa评分显著高于Sham组（表1），说明大鼠局灶性脑缺血再灌注模型构建成功。与I∕R组相比，Tβ4组Long 评分显著降低（表1）。

表1 大鼠脑缺血再灌注后神经功能评分、脑梗死体积及细胞凋亡指数比较Tab.1 Comparison of neurological function score，cerebral infarction volume and apoptotic index in different groups x±s

2.2 大鼠脑缺血再灌注后脑梗死体积变化 脑缺血2 h 再灌注24 h 后，对各组大鼠脑组织进行TTC染色。在Sham组中，脑切片全部是红色的，没有观察到梗死区。然而，I∕R组和Tβ4组存在一些白色梗死区域，与动脉栓塞范围一致。结果显示，与Sham组相比，I∕R组和Tβ4组脑梗死体积显著增加，Tβ4组脑梗死体积显著小于I∕R组（表1、图1）。

图1 Tβ4 对SD 大鼠脑梗死体积的影响Fig.1 The effects of thymosin β4 on cerebral infarction volume in SD rats

2.3 大鼠脑梗死周边区细胞凋亡指数比较TUNNEL 法检测凋亡结果显示，I∕R组凋亡率显著高于Sham组。与I∕R组比较，Tβ4组细胞凋亡指数显著降低（表1）。

2.4 各组大鼠脑组织SOD、GSH-Px 活性和MDA含量比较 与Sham组比较，I∕R组脑组织中SOD和GSH-Px 活性显著降低，而MDA 含量显著升高；与I∕R组 比 较，Tβ4组SOD 和GSH-Px 活性升高，MDA 含量降低（表2）。

表2 大鼠脑缺血再灌注后SOD、GSH-Px 活性和MDA 含量变化Tab.2 SOD，GSH-Pxactivity and MDA content after cerebral ischemia-reperfusion in rats ±s

表2 大鼠脑缺血再灌注后SOD、GSH-Px 活性和MDA 含量变化Tab.2 SOD，GSH-Pxactivity and MDA content after cerebral ischemia-reperfusion in rats ±s

注：与Sham组比较，#P＜0.05；与I∕R组比较，*P＜0.05

组别Sham组I∕R组Tβ4组SOD（U∕mgprot）116.82±12.62 75.20±11.71#94.97±10.31#*GSH-Px（U∕mgprot）73.54±8.77 40.17±7.15#61.15±10.31#*MDA（nmol∕mgprot）6.92±0.74 12.15±1.75#8.17±0.91#*

3 讨论

氧化损伤被认为是脑缺血∕再灌注损伤的重要因素之一［9-12］，脑缺血再灌注损伤后，氧化系统和抗氧化系统的平衡被破坏，机体产生大量的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），ROS 引起膜脂质过氧化反应，导致机体发生病理性损伤。MDA、GSH-Px 和SOD 与氧自由基密切相关［13-15］，SOD 和GSH-Px 是体内对抗ROS 过多产生的两种主要抗氧化酶，能清除氧自由基，起到保护机体免受氧化损伤的作用，二者活力的高低能够反应机体清除氧自由基能力和抗氧化能力。MDA 为脂质过氧化产物，其含量与氧自由基含量呈正相关，可以反映机体内脂质过氧化水平及受氧化应激损害的程度。

如前所述，Tβ4 是一种由43 个氨基酸残基组成的小分子多肽，在机体广泛分布，近年来多位学者报道了其神经保护作用，可作为神经损伤和神经退行性疾病的修复∕再生疗法［16］，改善3 个月龄大鼠栓塞性卒中模型的神经功能［17］，可促进中枢神经系统脱髓鞘疾病中的少突胶质细胞生成［18］。MORRIS 等［19-20］的研究发现，Tβ4 治疗可以减少老年雄性Wistar 大鼠脑梗死体积，改善大脑中动脉栓塞后卒中大鼠的神经功能。本研究发现，Tβ4干预可减少脑梗死体积9%左右，改善大脑中动脉栓塞后SD 大鼠的神经功能，与MORRIS 等［19-20］的报道一致。为了进一步分析Tβ4 改善神经功能的机制，实验进一步分析了与氧化损伤相关的SOD、GSH-Px 和MDA 含量，结果发现，Tβ4 处理显著降低了MDA 含量，显著上调了GSH-Px 和SOD 的活性，提示减轻氧化损伤，清除氧自由基可能是Tβ4抑制神经细胞凋亡和改善神经功能的重要机制。综上所述，Tβ4 可能通过降低MDA 含量，提高SOD、GSH-Px 的活性，清除氧自由基、减轻氧化损伤来抑制细胞凋亡、提高组织抗氧化能力，从而减少脑梗死体积，改善神经功能。

本研究结果提示，Tβ4 具有治疗脑缺血的潜在临床应用价值。然而，本研究仅在动物模型水平进行了探讨，这也是本研究也有不足之处，下一步将在细胞模型水平进一步深入研究。