黄芪甲苷Ⅳ对非酒精性脂肪肝小鼠肝脏脂质代谢的作用

杨小颖 胡芳 韦晓虹 HEAN Povkanha 孙辽

中山大学附属第五医院内分泌与代谢病科（广东珠海519000）

随着肥胖和2 型糖尿病等代谢性疾病的流行，非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）也由于其迅速增长的发病率而备受关注［1］。NAFLD 的全球性流行可能与人们摄入食物热量以及静坐生活方式的增加有关［2］。NAFLD表现为肝内甘油三酯的过度沉积［3］，它是目前最常见的慢性肝脏疾病，可以从单纯性脂肪变性发展成脂肪性肝炎，最终导致肝纤维化、肝硬化甚至肝癌［4］。然而，目前除了饮食控制和运动所致的体质量减轻外，并没有有效的治疗NAFLD 的方法［5］。黄芪甲苷Ⅳ是从黄芪提取物中纯化的主要生物活性成分，本课题组前期研究显示，黄芪甲苷Ⅳ能显著减轻游离脂肪酸诱导的肝细胞脂质沉积［6］，但黄芪甲苷Ⅳ是否能在体内发挥作用尚未清楚。因此，本研究通过动物实验，研究黄芪甲苷Ⅳ对高脂高糖饮食诱导的NAFLD 小鼠肝脏脂质代谢的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 5 周龄雄性C57BL∕6 小鼠40 只，购自广东省医学动物实验中心（合格证编号为：NO.44007200044791），适应性喂养1 周后体重为（20.08±1.00）g，所有小鼠分笼喂养，自由进食饮水，12 h 光∕暗周期交替，室温22～26 ℃。

1.1.2 试剂和仪器 高脂饲料（D12492）购于广东省医学动物实验中心，普通饲料购自北京华阜康生物科技股份有限公司；黄芪甲苷Ⅳ购自上海研瑾生物科技有限公司。1%羧甲基纤维素（CMC）、果糖和葡萄糖购自上海超研生物科技有限公司；乙醇、二甲苯、氨水购自珠海市香洲诺狄化玻仪器商行，伊红染色液购自广州华奇盛生物科技有限公司，苏木素染色液购自biosharp，中性树胶购自中国上海懿洋仪器有限公司；油红O 染料购自广州捷倍斯生物科技有限公司，甘油明胶购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 高脂高糖饮食诱导NAFLD 小鼠模型及药物干预 5 周龄雄性C57BL∕6 小鼠适应性喂养正常饲料1 周后，随机分为正常饮食组（normal diet，control，n= 8）、高脂高糖饮食组（high fat and highsugar diet，HFD，n= 8），高脂高糖饮食+AS-Ⅳ30 mg∕（kg·d）组（HFD+30AS-Ⅳ，n=8），高脂高糖饮食+AS-Ⅳ60 mg∕（kg·d）组（HFD+60AS-Ⅳ，n= 8），高脂高糖饮食+ AS-Ⅳ120 mg∕（kg·d）组（HFD+120AS-Ⅳ，n=8）。正常饮食包含20%kCal 来源于脂肪，60% kCal 来源于蛋白质，20% kCal 来源于碳水化合物。高脂饮食主要包含60%kCal 来源于脂肪，20%kCal 来源于蛋白质，20%kCal 来源于碳水化合物。高糖饮食是把糖加入饮用水中，以果糖55%、葡萄糖45%的比例配成42 g∕L。AS-Ⅳ用1%CMC 溶解后每日灌胃1 次，灌胃13 周，每周称量体质量、随机血糖。13 周后采用1%戊巴比妥钠麻醉小鼠，用颈椎脱臼法处死小鼠。

1.2.2 H&E 染色观察肝脏组织切片 新鲜肝脏组织在10%中性甲醛溶液中进行固定24 h 后，常规脱水（梯度酒精：70%、85%、95%、无水乙醇），透明（二甲苯），浸蜡，石蜡包埋，连续切片，切片厚度4 μm，然后可进行HE 染色。切片常规经二甲苯脱蜡，梯度酒精水化；浸泡于苏木素3 min，盐酸酒精分化1 s，氨水返蓝1 min，伊红酒精浸染3 min，梯度酒精脱水，中性树胶封片，待胶干后显微镜下观察结果。

1.2.3 油红O 染色观察肝脏组织切片 新鲜肝脏组织用包埋剂包埋后置于-80 ℃冰箱保存，然后可进行连续切片，切片厚度10 μm，切片置于-20 ℃冰箱保存。染色时，肝脏冰冻切片室温回温，4%多聚甲醛固定10 min，蒸馏水浸洗，洗掉包埋剂；60%异丙醇浸洗2 min，便于着色；油红O 工作液染色30 min 后，60%异丙醇调色20 s 左右，调色结束后，蒸馏水浸洗，苏木素染色液复染30 s，盐酸酒精分化1 s，最后蒸馏水浸洗2 次，甘油明胶封片，待胶干后显微镜下观察结果。

1.3 统计学方法 使用SPSS 20.0 软件统计分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验。P＜0.05 认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠血糖、体质量和肝脏湿重的比较图1A 显示自第9 周起，HFD组小鼠的随机血糖比Control组高（P＜0.05），但AS-Ⅳ并不能降低NAFLD小鼠的随机血糖。图1B-1D 显示自第3 周起，与Control组相比，HFD组小鼠的体质量变化差异有统计学意义（P＜0.05）。图1E 表明HFD组较Control组小鼠的肝脏湿重增加（P＜0.05）。图中还表明与HFD组相比，用不同浓度的AS-Ⅳ干预后，小鼠的体质量和肝脏湿重并未见明显变化，其中，HFD+60AS-Ⅳ体质量有减轻的趋势，该组肝脏湿重也有减少，其余两组小鼠的体质量和肝脏湿重与HFD组相似。这表明AS-Ⅳ浓度为60 mg∕（kg·d）时，可能减轻非酒精性脂肪肝小鼠的体质量和肝脏湿重。

2.2 肝脏组织H&E染色 图2显示400×高倍视野下HFD 小鼠较Control组小鼠肝脏脂质沉积明显增多，而给予不同浓度的AS-Ⅳ干预后，肝脏脂质沉积明显减少，以浓度为60 mg∕（kg·d）的AS-Ⅳ组最明显。

2.3 肝脏组织油红O 染色 图3A 显示400×高倍视野下的油红O染色结果，图3B是对油红O染色结果的定量分析。从图中可以看到，Control组小鼠肝脏脂滴形成较少，HFD组小鼠肝脏可见明显脂滴形成（P＜0.05）；给予不同浓度的AS-Ⅳ干预后，肝脏脂滴形成明显减少，以浓度为60 mg∕（kg·d）的AS-Ⅳ组最明显（P＜0.05）。

图2 肝脏组织H&E 染色（×400）Fig.2 H&E Staining of Liver Tissues（×400）

3 讨论

流行病学的研究表明，非酒精性脂肪肝目前是全球性健康问题［7］，随着静坐方式和高能量物质摄入的增加，它的发病率呈增长趋势［8-9］。非酒精性脂肪肝包括从单纯性脂肪变性到合并或不合并纤维化的脂肪性肝炎的一系列肝脏损伤［10］，单纯性脂肪变性是指肝脏甘油三酯在肝细胞中的积聚超过5%［11］，它通常是良性的，但可以发展成脂肪性肝炎，脂肪性肝炎除了肝脏甘油三酯的积聚外，还包括小叶炎症和肝脏损伤的特征性改变，它最终可以导致肝纤维化、肝硬化甚至肝癌［12］。在过去几十年里，人们不断地研究非酒精性脂肪肝的病因、发病机制、治疗等方面，对非酒精性脂肪肝也取得了一定的了解。然而，在非酒精性脂肪肝的各个方面中，治疗取得的进展最慢［13］，目前仍然没有有效的治疗非酒精性脂肪肝的方法。因此NAFLD 的药物防治研究近年来成为研究的焦点。从中药提取物中纯化的生物活性化合物更是研究热点［14］。在中国药典中，黄芪被描述为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，是一种常用的中草药［15-16］。根据《神农百草经》和《本草纲目》的记载，黄芪治疗作用广泛，归为滋补药，被认为能提高免疫力、治疗糖尿病等［17］。黄芪甲苷Ⅳ是从黄芪提取物中纯化的主要生物活性成分，它广泛用于代谢疾病的中药治疗，作用与黄芪类似［18］。既往研究表明，黄芪能改善2 型糖尿病大鼠的胰岛素抵抗和肝脏脂质沉积［19］。有文献报道，AS-Ⅳ可能通过增加脂肪组织瘦素的敏感性以及调节能量代谢，从而有效地改善肥胖小鼠的脂质代谢［20］。本课题组在游离脂肪酸诱导的HepG2 细胞和小鼠原代肝细胞脂质沉积模型中发现，激活AMPK 可上调ACC 和SREBP-1c 的磷酸化水平，抑制SREBP-1 核内转移，下调脂质合成基因的mRNA 水平而改善肝细胞脂质沉积［6］。然而，AS-Ⅳ是否能改善小鼠体内的肝脏脂质沉积尚未清楚。因此，本研究采用高脂高糖饮食构建非酒精性脂肪肝小鼠模型，每日灌胃不同浓度的AS-Ⅳ，从而观察AS-Ⅳ对非酒精性脂肪肝小鼠的作用。研究结果表明AS-Ⅳ能减轻NAFLD 小鼠的肝脏脂滴形成，当浓度为60 mg∕kg 时，AS-Ⅳ的作用最显著。

图3 肝脏组织油红染色（×400）Fig.3 Oil Red O staining of liver tissues（×400）

综上所述，本研究证实了AS-Ⅳ能减轻非酒精性脂肪肝小鼠的肝脏脂质沉积，但AS-Ⅳ能否通过活化AMPK 来减少肥胖小鼠的肝脏脂质沉积，目前尚未清楚，为此我们下一步将进行具体的机制探讨。