2015-2017年重庆地区感染HPV各基因型及分布特点

霍兆群，吴晓辉，李嘉燕，卢志云，毕庆军，涂干卿

(重庆金域医学检验所科研组，重庆 400039)

宫颈癌是女性发病率居第2位的恶性肿瘤，也是目前病因较明确的恶性肿瘤之一，人乳头瘤病毒(HPV)较长期反复感染是其主要病因。我国宫颈癌患病率及病死率均较高，且有年轻化趋势，严重危害女性健康[1]。因此，HPV感染越来越引起人们的关注，各国学者从不同角度对HPV感染型别和疫苗进行研究，取得一定的成绩[2]。HPV感染率及型别分布在不同种族和地域存在差异[3-5]，因受检病例量及检查条件的关系，其感染率及分布特点各项研究报道有较大差异[3-15]。现将本检验所对重庆市超14万例次女性检测HPV感染的研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1标本来源 选取本检验所实验室2015年1月1日至2017年12月31日接收的重庆市三大行政片区(渝东北、渝东南、渝西及主城)各级医院(344家)专门采集并送检的女性患者宫颈区细胞作为HPV-DNA检测样本。

1.2仪器与试剂 黑马9600基因扩增仪(珠海黑马)，伯乐GELDOC XR+凝胶成像系统，全自动核酸分子杂交仪(亚能)，基因杂交信号扩大仪(DML2000TM)，ABI 3500xL基因分析仪，液基薄层细胞(TCT)制片仪(海世嘉)，OLYMPUS BX41显微及摄像系统。PDE柱DNA提取试剂盒及PCR-斑点杂交法HPV-DNA分型检测试剂盒(亚能)，高危型HPV-DNA (hrHPV)第二代捕获杂交法(HCⅡ)检测试剂盒(凯杰)，设计单一各型的特异性引物(见表1)，Digestion Solution for MagJET gDNA Kit切胶回收试剂盒及3500 Dx Series Sequencing Standard,BigDyeTMTerminator v1.1测序试剂盒(赛默飞公司)，巴氏染液。

1.3检测方法 所有送检样本均在采集的当天8 h内，进行PCR-斑点杂交法HPV-DNA分型检测，结果为阳性的作TCT检查。另选取64例HPV-DNA检测结果为阳性的患者，再同时进行PCR-斑点杂交法和HCⅡ法比对检测。并选取HPV-DNA高危和低危型检出率高的亚型在基因分析仪上作基因测序、鉴定。

1.3.1采样要求 于检查前3 d内未做阴道冲洗，未阴道内用药(避孕药等)。检查前24 h内无性行为。采样时仰卧于检查床上，消毒(不能用醋酸或碘液涂抹消毒)，由医生以窥阴器或阴道张开器暴露宫颈，用棉拭子将宫颈口过多的分泌物擦去，然后用HPV专用采样刷及专用宫颈脱落细胞采集器，进行采样，单方向旋转4～5周以获得足量的上皮细胞样本，然后将宫颈刷头部分别放入洗脱管中，沿刷柄处将宫颈刷折断，拧紧洗脱管盖，做好样本标识，保持洗脱管直立放置。用于PCR-斑点杂交法HPV-DNA分型检测采样管一套，HCⅡ法检测专用采样管一套，TCT细胞学检查采集器一套，分别采集。

1.3.2HPV-DNA分型检测方法 采用PCR-斑点杂交法，按照该法检测试剂盒操作规程，制备DNA模板、PCR扩增(根据HPV-DNA特点设计特异引物PCR Premix，可以扩增出23种HPV-DNA亚型目的片段)，再将扩增产物与固定在膜条上的17种hrHPV和6种低危型(lrHPV)的分型探针，用全自动核酸分子杂交仪进行杂交，依据杂交信号点有无存在，来判断有无HPV感染及其基因型别。

表1 hrHPV和lrHPV检出率高的亚型所用的单一特异性引物

1.3.3hrHPV-DNA HCⅡ检测方法 按照HCⅡ检测试剂盒提取DNA模板，含有目标DNA的标本与一种特殊的HPV-RNA探针鸡尾酒杂交,反应形成的RNA-DNA杂交体，捕获到被有RNA-DNA杂交体相对应特异抗体的酶标板小孔杯里,被固定好的杂交体与接合了RNA-DNA杂交体相对应特异抗体的碱性磷酸酯酶反应，再用化学发光底物进行检测。发光射出用照度计测量其相对光单位，根据发出光的强度确定样本中有无目标DNA存在，并定量。

1.3.4HPV-DNA测序、鉴定 使用单一特异性引物，对提取的样本DNA模板进行扩增，采用1.5%琼脂糖凝胶电泳(120 V，40 min)，并用凝胶成像系统进行检测。再使用Digestion Solution for MagJET gDNA Kit切胶回收试剂盒对与目标片段大小一致的电泳条带进行切胶回收，按照3500 Dx Series Sequencing Standard,BigDyeTMTerminator v1.1测序试剂盒进行配液，将配制好的反应液于ABI 3500xL基因分析仪上进行双向测序，并与NCBI官网上的相对应的基因序列进行Blast分析。

1.3.5TCT细胞病理学检查方法 经TCT制片仪将样品制成直径15 mm的圆形细胞薄层涂片进行巴氏染色，在显微镜下阅片检查，并对典型视野摄片，根据上皮细胞及相关细胞形态变化情况，确定变化级别。

1.3.6检测方法的质量控制 采用留样标本(每批的高值、临界水平、阴性)复查方法，每天做室内质控，每年参加两次国家卫健委组织的室间质评，符合质控要求，检测结果有效。

1.4统计学处理 检测结果按年度、各年龄段、各行政片区、各基因型进行统计分析。采用SPSS19.0软件进行数据分析，计数资料采χ2检验。检验水准α=0.05，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各年份HPV-DNA分型检测情况 2015-2017年3年间共计检测样本143 083例(同一患者多次检查计为1例)，其中，检出HPV-DNA阳性36 312例(同一个样本检出多种亚型阳性也计为1例)，阳性检出率25.38%；2015年检测样本39 279例，检出阳性10 609例，阳性检出率27.01%；2016年检测样本45 350例，检出阳性12 011例，检出率26.49%；2017年检测样本58 454例，检出阳性13 692例，检出率23.42%。3年阳性检出率差异有统计学意义(P<0.05)，有逐年降低趋势。

2.2各年龄段HPV-DNA分型检测情况 18～45岁年龄段检测样本108 547例，检出HPV-DNA阳性26 851例，阳性检出率24.74%；45岁以上年龄段检测样本34 536例，检出阳性9 461例，阳性检出率27.39%。后一年龄段阳性检出率明显高于前一年龄段，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3各片区HPV-DNA分型检测情况 3年间共计检测渝西及主城的样本111 091例，检出HPV-DNA阳性27 147例，阳性检出率24.44%；渝东北的样本17 779例，检出阳性5 655例，阳性检出率31.81%；渝东南样本14 213例，检出阳性3 510例，阳性检出率24.70%。渝东北片区阳性检出率明显高于另外两个片区，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4HPV-DNA各基因亚型阳性检出情况

2.4.13年间各基因亚型阳性检出情况 3年间HPV-DNA检出阳性中占比超过10%的有HPV基因型有52、16、58、81亚型，以52亚型最高，达23.16%。见图1。

图1 2015-2017年3年间各基因亚型阳性检出情况

2.4.22个年龄段各基因亚型阳性检出情况 在HPV-DNA检出阳性中占比达10%的:(1)18～45岁年龄段，包括52、16、58、81亚型，占比分别为22.80%，16.29%，11.02%，9.75%；(2)45岁以上年龄段，包括52、16、58、53、81亚型，占比分别为24.16%，18.51%，14.68%，11.69%，11.49%。2个年龄段各检出的亚型占比居前3位的亚型基本一致，均以52亚型最高。

2.4.3三大片区各基因亚型阳性检出情况 在HPV-DNA检出阳性中占比达10%的:(1)渝西及主城，包括52、16、58、81、6亚型，占比分别为23.12%、16.10%、11.28%、10.58%、9.48%；(2)渝东北，包括52、16、58、53亚型，占比分别为22.69%、19.77%、14.75%、9.12%；(3)渝东南，包括52、16、58、53亚型，占比分别为24.19%、18.12%、12.93%、9.74%。各片区检出的亚型占比居前3位的亚型基本一致，均以52亚型最高。

2.5hrHPV-DNA检出情况 hrHPV包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、82等17个亚型(6、11、42、43、81、83亚型属低危型lrHPV)。3年间共计检测样本143 083例，检出HPV-DNA阳性36 312例，其中hrHPV 30 880例(同一个样本检出多种hrHPV亚型阳性计为1例)，检出率为21.58%，在检出阳性中占比85.04%。

2.5.1各年份hrHPV检出情况 2015年检测样本39 279例，检出HPV-DNA阳性10 609例，其中hrHPV 8 906例，hrHPV检出率22.67%，在检出阳性中占比83.95%；2016年检测样本45 350例，检出阳性12 011例，其中hrHPV 10 174例，hrHPV检出率22.43%，在检出阳性中占比84.71%；2017年检测样本58 454例，检出阳性13 692例，其中hrHPV 11 800例，hrHPV检出率20.19%，在检出阳性中占比86.18%。3年间hrHPV检出率呈现下降趋势，但在检出阳性中占比差异有统计学意义(P<0.05)，且呈现上升趋势。

2.5.22个年龄段hrHPV检出情况 18～45岁年龄段检测样本108 547例，检出HPV-DNA阳性26 851例，其中hrHPV 22 723例，hrHPV检出率20.93%，在检出阳性中占比84.63%；45岁以上年龄段检测样本34 536例，检出阳性9 461例，其中hrHPV 8 157例，hrHPV检出率23.62%，在检出阳性中占比86.22%。hrHPV检出率和在检出阳性中占比，45岁以上年龄段明显高于18～45岁年龄段，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.5.3三大片区hrHPV检出情况 3年间渝西及主城检测样本111 091例，检出HPV-DNA阳性27 147例，其中hrHPV 22 959例，hrHPV检出率20.67%，在检出阳性中占比84.57%；渝东北检测样本17 779例，检出阳性5 655例，其中hrHPV 4 894例，hrHPV检出率27.53%，在检出阳性中占比86.54%；渝东南检测样本14 213例，检出阳性3 510例，其中hrHPV 3 027例，hrHPV检出率21.30%，在检出阳性中占比86.24%。hrHPV检出率渝东北片区明显高于另外两个片区，差异有统计学意义(P<0.05)，在检出阳性中的占比，渝西及主城片区低于另外两个片区，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.6同时感染HPV多种基因亚型的检出情况 3年间各年份、各片区、各年龄段检出的阳性均以同时感染HPV 1种和2种基因亚型为多见，差异有统计学意义(P<0.05)，检出阳性中占比分别达到69.0%和19.1%。见图2。

图2 同时感染HPV多种基因亚型的检出情况

2.7HPV-DNA同时用两种检测方法检查情况 选择64例HPV-DNA分型检测属hrHPV阳性者，再次按规范采样，同时用PCR-斑点杂交法及HCⅡ方法进行HPV-DNA检测，PCR-斑点杂交法检出阳性 47 例，阴性 17 例，阳性检出率73.44%；HCⅡ法检出阳性 35 例，阴性 29 例，阳性检出率为67.31%(35/52,因64例中有12例不属于HCⅡ法检测范围，计算时未计入总例数，计入在阴性数)，2种方法检测均为阳性的34例，均为阴性的16例，2种方法结果一致的例数为50例，符合率96.2%(50/52,因64例中有12例不属HCⅡ法检测范围，计算时未计入总例数)。

2.8HPV-DNA分型检测阳性者同时作TCT细胞病理学检查情况 2015-2017年共有7 168例HPV-DNA分型检测阳性者同时作TCT宫颈细胞病理学检查，其中属hrHPV的有5 835例，TCT检查报告结果CINⅠ 481例，检出占比 8.24 %，CINⅡ 321例，检出占比5.50%，ASCUS 649例，检出占比11.12%；属lrHPV的有1 333例，TCT检查报告结果CINⅠ 96例，检出占比7.20%，CINⅡ 7例，检出占比0.53%，ASCUS 107例，检出占比8.03%。hrHPV的CINⅡ检出占比明显高于lrHPV(P<0.05)。本组病例检查结果显示，HPV感染导致宫颈及阴道上皮细胞异形改变的比例并不高，有CIN改变的检出占比均低于10.0%，也未发现宫颈及阴道上皮细胞癌变。

2.9hrHPV和lrHPV检出率高的亚型在基因分析仪上作基因测序、鉴定情况 经PCR后凝胶电泳成像系统检测结果见图3，各亚型均在130～170 bp处显现成像带；正向和反向测序Blast结果，仅选hrHPV的52型测序的Blast结果作为代表，结果显示，检测的一种亚型测序Blast结果，一致性在95%以上，各亚型测序的Blast结果，一致性也均在95%以上。将各型测序结果分别与NCBI相对应基因型的全长质粒比对，一致性均在99%以上，说明检出的各基因亚型符合该HPV基因型的特征。

注：M为标志物，6为6亚型，16为16亚型，52为52亚型，53为53亚型，58为58亚型，81为81亚型

图3 PCR后凝胶电泳成像检测结果

3 讨 论

HPV是一种双链嗜上皮性DNA病毒，属乳多空病毒科，具有高度种属及组织特性。人类皮肤角质形成细胞/黏膜鳞状上皮细胞是其天然宿主，男、女性皆可感染。HPV以通过性活动传播为主[3]，在全球性传播疾病中HPV的感染占15%～20%，75%的性活跃成人，一生中皆感染过此病毒[4-8]。HPV感染能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖，表现为寻常疣、生殖器疣等症状，并可进展为癌前病变及浸润性癌。各国学者从不同角度，对HPV致病谱及感染率、病毒结构及变异、致癌机制、基因亚型、流行病学及地域分布差异等多方面进行研究，取得一定的成绩，报道了不少资料[3-19 ]。国际癌症研究协会报道全球25个国家的3 607例宫颈癌患者中HPV 16亚型的感染率为57.4%，18亚型感染率居第2位，非洲、欧洲、东南亚及北美洲报道45亚型感染率居第3位[4-8]。我国报道不同的地区和人群感染HPV型别及分布相差较大，其感染率在20.7%～58.4%间[3，9-13]。也有报道HPV 16亚型是最为常见的感染型别，占所有HPV感染型别的33.54%[11]。本研究项目采用大数据对重庆市地区感染HPV情况的分析，显示2015-2017年，共计检测女性样本143 083例，检出HPV-DNA阳性36 312例，阳性率25.38%，在国内文献报道的HPV感染率范围内。检出hrHPV 30 880例，检出率为21.58%，在检出的阳性中占比85.04%，这比张海伟等[14]报道的重庆地区hrHPV感染率为27.49%要低。但在2015-2017年检出的HPV-DNA阳性中hrHPV占比呈现上升趋势，感染基因型以HPV 52亚型为主，在阳性中占比23.16%，依次还有HPV16型，占比16.86%，HPV 58型，占比11.98%，HPV 81型，占比10.20%，HPV 53型，占比9.39%，三大行政片区和两个年龄段的检出情况也基本一致，这与有关文献报道类似[11-14]，国内香港、广州、湖南地区报道均以HPV 52及582个亚型居多，日本也类似，因而有文献报道称HPV 52，58型为亚洲型[11-14]。同时，重庆地区以HPV单一亚型感染为主，占比69.0%，二重亚型感染占比19.1%，多重亚型感染检出率不高，这也与国内有关文献报道类似[11-14]。

HPV-DNA根据基因序列不同目前已经分出100余种亚型，有40多种与生殖道感染、20多种与肿瘤病变有关[3]，根据其致病力情况分为hrHPV和lrHPV两大类。近些年用于HPV-DNA分型检测的方法有多种，本研究对HPV-DNA的分型检测，选用PCR-斑点杂交法为主要检查方法，这是目前采用较多的分型检测法，可分析检出23种亚型，其中hrHPV 17种，lrHPV 6种，检测灵敏度较高，也被用来作HPV-DNA感染的筛查方法。本项目选取的比对检测方法为HCⅡ法，可对hrHPV中的13种亚型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68亚型)感染进行HPV-DNA半定量测定，结果准确性较高；但其检测亚型范围稍较局限，并不能作分型检测，多用作hrHPV中的13种亚型感染患者的疗效观察检测，因HPV感染在治疗期间还可能有型别的改变，疗效观察作分型检测意义不及HCⅡ对HPV-DNA半定量检测意义。本研究通过对2种方法进行对比检测发现，结果符合率达96.2%，在HPV感染的诊治过程中，2种方法配合选用对临床是很有价值的。本研究针对检出率高的hrHPV和lrHPV的各亚型，在基因分析仪上作了基因测序、鉴定，其各亚型的Blast结果，一致性均在95%以上，与NCBI中相对应基因的全长质粒比对，一致性均在99%以上，说明本研究检出的各基因亚型符合HPV该基因型特征。

本研究结果显示，HPV感染存在各年龄段、不同地域分布差异。45岁以上年龄段阳性检出率27.39%，高于18～45岁年龄段阳性检出率24.7%，差异有统计学意义(P<0.05)，并且hrHPV的检出率和在检出阳性中占比也是如此，这可能与该年龄段的女性患者性活动次数累积增多，感染概率增大有关，不过近年报道有年轻化增多的趋势。因此，女性的个体日常卫生、特别是经期卫生和同房前后的良好卫生习惯应强化宣教，另一方面，各年龄段的已婚女性都应重视健康体检，这些都是降低HPV感染概率的重要措施。女性乳腺癌和宫颈癌筛查在我国已较广泛地开展，HPV-DNA分型检测，是其中重要的检查项目，也是目前防治女性HPV感染很重要的措施。本研究还将重庆市分为渝西及主城、渝东北、渝东南三大片区进行HPV感染情况比对分析，渝东北片区阳性检出率为31.81%，明显高于其他两个片区的24.70%和24.44%，差异有统计学意义(P<0.05)。这说明HPV感染率的地域差异不仅存在于洲际间、国际间、省级间的大区域间[3-9]，同一省、市的不同片区间也都有差异，这可能与不同地区的女性个人卫生习惯不同有一定关系。重庆本市三大片区都以hrHPV感染为主，在检出阳性中的占比均超过84%，说明本地区的任何一个片区，HPV感染的严峻性都不容忽视。

宫颈癌是目前病因较明确的肿瘤之一，有报道显示99.7%的宫颈癌组织活检标本中可检测到HPV-DNA，hrHPV较长期反复感染是主要病因[7,15]，其病理机制，首先是导致宫颈上皮细胞内瘤变(CIN)、生殖道细胞CIN变，继而发展成宫颈癌。有报道显示，近年来CIN及宫颈癌的发病率有明显增多趋势[5]。本研究对2015-2017年7 186例HPV-DNA检测阳性的病例同时作了TCT，其中属hrHPV的有5 835例，占比81.2%，TCT检查结果CINⅠ 481例，检出占比8.24%，CINⅡ 321例，检出占比5.50%，ASCUS 649例，检出占比11.12%。HPV感染导致宫颈细胞异形改变的比例并不高，有CIN改变的检出占比均低于10%。国内有关宫颈细胞病理学检查，CIN的检出占比的报道数据差异较大[18-19]，究其原因，检查病例量的差异有一定影响，另一方面，样本采集的影响也是一重要因素，从1个患者的宫颈所刷取的细胞量对检查结果影响很大，特别是一次采集要同时分作两项以上的检查，对结果的影响就更大。所以本研究在分析报道的宫颈癌筛查结果有关统计数据时要注意考虑这些影响因素。不过，无论一篇报道的统计数据如何，改变不了hrHPV较长时间反复感染导致宫颈上皮细胞、生殖道细胞CIN变，继而发展成宫颈癌的这一共识，同时，HPV-DNA分型检测对于细胞病理医生作宫颈细胞CIN分级检查和临床医生有效区分易患宫颈癌的高危妇女有重要价值[21]，所以在女性的宫颈癌防治中要高度重视HPV感染的诊治。

4 结 论

hrHPV较长期反复感染已明确为宫颈癌的主要病因，HPV的感染已越来越引起人们的关注。我国为了女性的健康已将婚育妇女的宫颈癌防治工作提到重要日程，在全国广范开展预防普查工作，HPV-DNA分型检查和TCT检查已作为宫颈癌的筛查项目，本研究正是配合该工作的重要课题，其结果为重庆市建立HPV感染人群的诊断及防治体系提供有力的科学依据，为该病原疫苗的研发和应用提供本地高信息量的流行病学资料，进而为降低女性宫颈癌的发生率做出贡献。

(志谢：重庆市人民医院中山院区妇科陈健英副主任医师临床采集科研样本)