难治性慢性丙型肝炎中医证型与HLA-DP基因SNP的相关性研究

韩竖霞，郑 毅，彭晓明，赵友云△

(1.湖北省中医院检验科，湖北武汉 430061；2.湖北省中医药研究院，湖北武汉 430074)

ThecorrelationanalysisbetweensyndrometypesoftraditionalChinesemedicineandHLA-DPgenepolymorphismsinpatientswithrefractorychronichepatitisC*

HANShuxia1,2,ZHENGYi1,2,PENGXiaoming1,2,ZHAOYouyun1,2△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,HubeiProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Wuhan,Hubei430061,China;2.HubeiProvinceAcademyofTraditionalChineseMedicine,Wuhan,Hubei430074,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the correlation between syndrome types of traditional Chinese medicine (TCM) and HLA-DP gene polymorphisms in patients with refractory chronic hepatitis C (RCHC),and to find suitable molecular markers for TCM syndromes and provide scientific basis for TCM syndrome differentiation.MethodsA total of 200 RCHC patients of Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine were enrolled retrospectively.Their general characteristics,TCM syndromes,data of liver function (ALT，AST，ALP and ALB),HCV RNA,HCV genotypes,PT and PLT were collected.At the same time,100 patients from other departments of the hospital were enrolled as control group.FQ-PCR was used to detect the genotypes of the HLA-DP gene rs9277535 sites of the RCHC patients with different TCM syndromes and the patients of control group.The correlation between the data and TCM syndromes was statistically analyzed.ResultsAmong 200 patients in the study,the pattern of liver-depression and spleen-deficiency was maximum (100 cases,50.0%),while the remaining syndromes were dampness and heat resistance (48 cases,24.0%),yin deficiency of liver and kidney (32 cases,16.0%) and obstruction of collaterals by blood stasis (20 cases,10.0%).For age,data of liver function index and HCV RNA,there was no statistical difference between the liver-depression and spleen-deficiency type and other TCM syndromes (P>0.05).But the difference of PT was significant between liver-depression and spleen-deficiency type and other TCM syndromes (P<0.05).Compared with control group,there was no significant difference between the HLA-DP gene rs9277535 genotype GG and AA in the liver depression spleen deficiency group and the non-liver depression spleen deficiency group in the RCHC patients (P>0.05).ConclusionThere was no significant difference between the genotypes of HLA-DP gene rs9277535 genotype GA heterozygous genes and AA homozygous genes in the different TCM syndromes of RCHC patients.However,the distribution of alleles G and A in liver depression spleen deficiency group and non-liver depression spleen deficiency group showed a different trend,which is worthy of further study.

Keywords:refractory chronic hepatitis C; traditional Chinese medicine； syndrome; HLA-DP; polymorphisms； HCV

丙型肝炎是嗜肝病毒中丙型肝炎病毒(HCV)引起的一种肝炎，感染后可以导致肝脏炎症性坏死甚至导致肝硬化和肝癌,由于其进展隐匿、慢性率高及预后不良而备受关注[1]。以干扰素为基础的治疗方案在临床上一度居于主导地位，但由于疗程长、有效率低、不良反应大等许多问题仍未得到根本解决，使得在治疗过程中，存在治疗无应答者、不耐受者、停药后复发者等，即难治性慢性丙型肝炎(RCHC)的产生[2]。

中医以其整体观和辨证论治的特点，在治疗RCHC上有一定的优势，可以通过分析不同患者的中医证型来进行个体化用药。然而，由于目前缺乏统一明确的丙型肝炎辨证分型标准，临床分型存在一定程度的主观性和随意性[3]。因此，需要寻找一种可重复、准确可靠的分子标志物以揭示中医证型的内涵，以此更好地指导临床医生个体化用药。白细胞抗原(HLA)DP基因编码HLA-DP抗原，此抗原的多少直接影响抗原递呈与免疫应答的过程。因此，本研究旨在探索人类HLA-DP基因单核苷酸多态性(SNP)常见位点的基因型与RCHC中医证型是否存在相关性，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 200例RCHC患者均为2015年1月至2016年12月在湖北省中医院住院的患者，按中医证型分为肝郁脾虚组和非肝郁脾虚组(含肝肾阴虚型、湿热内阻型、淤血阻络型)。其中肝郁脾虚组男55例，女45例，年龄20～80岁，平均54.45岁；非肝郁脾虚组男53例，女47例，年龄26～80岁，平均59.05岁。100例对照人群为湖北省中医院骨科、肛肠科、耳鼻喉科住院患者，性别和年龄与RCHC患者差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2诊断标准 RCHC的诊断均参考《丙型肝炎防治指南(2015更新版)》[4]； 肝郁脾虚型、肝肾阴虚型、湿热内阻型、淤血阻络型的中医证型分型参考2017年中华中医药学会肝胆病专业委员会制订的《病毒性肝炎中医辨证标准(2017年版)》[5]，以上判定均由两位主治医师共同判断，并由一位主任医师审核确定。

1.3纳入与排除标准 纳入标准：符合上述RCHC诊断标准且符合中医证型者，均签有知情同意书。排除标准：合并HIV和(或)其他嗜肝病毒感染的肝炎；伴有心、肾、肺、内分泌、血液、代谢及胃肠道严重原发病；不能合作者或精神病患者；哺乳、妊娠或正准备妊娠的妇女，以及过敏体质者。

1.4检测指标

1.4.1常规指标 肝功能相关指标[丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、清蛋白(ALB)]由RoCH moduleP800全自动生化分析仪完成；HCV RNA检测采用美国ABI Dx全自动荧光定量PCR仪完成；血小板计数(PLT)由贝克曼DxH 800完成；凝血酶原时间(PT)检测采用沃芬ACLTOP700完成。

1.4.2基因组DNA的提取及HLA-DP基因分型 按湖北省中医院用户手册标准采集所有研究对象外周静脉EDTA抗凝血液5 mL；依照基因组DNA提取试剂盒(北京天根公司生产)操作说明书的步骤提取人类基因组DNA；再采用超微量核酸分析仪(Eppendorf公司，德国)测定DNA浓度；根据HCV基因组5′-UTR、C/E1和NS5B的序列及HLA-DP基因rs9277535位点G/A，采用Vector NTI11.0软件设计引物和探针序列，送上海生工生物工程有限公司合成引物和探针序列，见表1。采用优化后的双重FQ-PCR技术同步检测标本中HLA-DP基因rs9277535位点G或A。优化后的双重荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)反应体系：2xTaqMan Fast qPCR Master Mix 5.00 μL，10 μmol/L正向引物0.25 μL，10 μmol/L反向引物0.25 μL，10 μmol/L A-、G-探针各0.20 μL，DNA模板0.20 μL，ddH2O 2.10 μL。

2 结 果

2.1RCHC中医证型的分布 200例RCHC中医证型中，肝郁脾虚证最多(100例)，占50.0%；其次分别是湿热内阻证(48例)，占24.0%；肝肾阴虚证(32例)，占16.0%；淤血阻络证(20例)，占10.0%。

2.2RCHC肝郁脾虚证和非肝郁脾虚证的基本信息和常规指标 RCHC肝郁脾虚证与非肝郁脾虚证相比，肝功能指标、HCV RNA含量及其基因型差异均无统计学意义(P>0.05)；其中RCHC患者不同证型的HCV基因型均以1b型为主，凝血系统中PT指标差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表1 HLA-DP基因rs9277535位点的FQ-PCR引物及探针序列

2.3RCHC不同证型患者HLA-DP基因rs9277535多态性 HLA-DP基因rs9277535位点中，与野生纯合型GG相比，GA杂合型和AA突变基因型在对照组、肝郁脾虚组和非肝郁脾虚组3组中的差异均无统计学意义(P>0.05)；等位基因G、A的分布在3组中差异也均无统计学意义(P>0.05),见表3。

表2 不同中医证型RCHC患者基本信息和常规指标比较

注：*表示肝肾阴虚型或湿热内阻型或淤血阻络型中任一证型均归为非肝郁脾虚组

表3 RCHC不同证型患者HLA-DP rs9277535多态性的分布情况[n(%)]

注：*为非肝郁脾虚组指肝肾阴虚型或湿热内阻型或淤血阻络型；#为对照组与肝郁脾虚组比较；△为对照组与非肝郁脾虚组比较；▲为肝郁脾虚组与非肝郁脾虚组比较

3 讨 论

近年来，人们对于慢性丙型肝炎的认识不断深入，国家卫生健康委员会疾病预防控制局官网发布的数据显示，每年该病的发病率和病死率也呈上升趋势。虽然中医、西医对慢性丙型肝炎的研究已经取得了很大的进展，治疗方面也取得了很大的突破，已有聚乙二醇干扰素(Peg-IFN)联合利巴韦林(RBV)的标准化治疗方案和DAA治疗方案，特别是DAA的上市是丙型肝炎治疗的一次飞跃，使其治愈率大大提高[6]。但由于我国丙型肝炎患者的高SVR率、居民经济承受能力、卫生经济学因素、DAA高昂的价格、未知的远期耐药、复发和药物间相互作用等诸多原因，使得Peg-IFN联合RBV治疗仍然是我国现阶段丙型肝炎抗病毒治疗的主要方案[7]。在治疗过程中存在治疗无应答者、不耐受者、停药后复发者；HCV的基因型为1型者；伴有肝炎肝硬化、非酒精性脂肪肝、代谢综合征、胰岛素抵抗者；HBV/HCV、HIV/HCV重叠感染者；器官移植患者等，均导致了RCHC的产生[8-10]。因此，RCHC已成为目前困扰肝病领域的重要科学问题。

HLA-DP分子主要分布于抗原递呈细胞(APC)，如巨噬细胞、树突状细胞、B淋巴细胞、胸腺上皮细胞和活化的T细胞等的表面。HLA-DP基因属于HLA-Ⅱ类基因，位于染色体6p21.23，其基因多态性与机体免疫应答相关，在肝硬化基因研究中，HLA基因逐渐受到关注。有学者通过Meta分析发现HLA-DP基因rs9277535位点A等位基因为HBV感染的保护因素，可显著增加HBV自发清除[11]。HUANG等[12]研究证实，HLA-DP rs9277535基因突变型与HCV持续感染和丙型肝炎慢性化进展速度相关，同时该基因还与肺癌、卵巢癌的发生风险，儿童HBV易感性，系统性红斑狼疮易感性等密切相关。

中医证型是RCHC辨证施治的关键。HLA-DP基因多态性与HCV持续感染密切相关，其个体化理念与中医辨证施治高度相似，课题组提出HLA-DP基因多态性与RCHC中医证型相关性的科学假说，寻找中医证型的分子标志物，为中医辨证提供科学依据。本研究结果显示，RCHC肝郁脾虚证与非肝郁脾虚证相比，肝功能、HCV-RNA水平及其基因型差异均无统计学意义(P>0.05)，但HCV基因型均以1b型为主；同时年长的RCHC患者更易出现非肝郁脾虚证，即肝肾阴虚型或湿热内阻型或淤血阻络型；凝血系统中PT指标差异有统计学意义(P<0.05)。

研究发现，HLA-DP基因rs9277535位点中，与野生纯合型GG相比，GA杂合型和AA突变基因型在对照组、肝郁脾虚组和非肝郁脾虚组3组间均无显著性差异；但等位基因G和A的分布在肝郁脾虚组和非肝郁脾虚组2组间有差异趋势，可作为中医证型分型的潜在标志物，对于传统中医理论研究具有一定的创新价值，可进一步研究。

4 结 论

本课题组在RCHC中医证型分子分型研究中，发现肝郁脾虚证最多，肝脏功能损伤程度及病毒水平在不同证型之间差异无统计学意义。HLA-DP基因rs9277535位点中等位基因G和A的分布在不同证型间有一定的差异趋势，因此，推断rs9277535位点中等位基因G和A可能是RCHC不同中医证型的潜在标志物，值得关注。本研究虽然得出了可能与RCHC中医证型密切相关的HLA-DP等位基因，但仍然难以明确定论。同时，由于本研究病例仅来自湖北省中医院，各种证型的病例数偏少，不够全面。因此，为更准确地反映HLA-DP基因SNP与RCHC中医证型的相关性，尚有待进一步扩大样本量，开展多地域、多民族的深入研究，以探索中医证型的分子机制。