基于COI基因的柴达盆地常见寄生蚤种的DNA条形码分析

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柴达木盆地在动物地理区划上属西部荒漠亚区，其蚤类区系以古北界种类为主，不少种属为青藏高原特有种，具有较高的科学价值[1]。蚤类除因叮咬和吸血等行为对动物造成直接危害外，其传播重大传染病的媒介效能(如鼠疫、地方性斑疹伤寒等)也奠定了蚤类的重要医学地位[2]。

医学病媒生物的鉴定与识别，是控制疾病发生的核心步骤，也是疾病监测的基础工作。常规形态学手段要求分类人员必须掌握扎实的分类知识，同时需要保持被鉴定标本完整且典型的分类特征。目前分类学者人数急剧缩减，使分类鉴定工作面临巨大挑战，急切需要一种物种鉴定新方法产生。DNA条形码技术的出现解决了形态鉴定的诸多困境[3-4]。在大多数动物类群中，线粒体细胞色素C氧化酶亚基I基因(COI)已被广泛采纳为通用的标准条形码基因片段[5-7]。鉴于上述原因，我们对柴达木盆地寄生蚤种的COI基因序列进行研究，以弥补传统形态分类法的不足，积累柴达木盆地寄生蚤COI基因部分序列的数据信息，探索建立医学媒介生物快捷鉴定的新方法，这对整个动物学分子鉴定及遗传学研究具有重要的学术意义。

1 材料与方法

1.1实验材料 本研究使用的68份蚤DNA样品，采自柴达木盆地1市2县的68匹蚤(样点分布如图1)。将保存于75%酒精中的蚤样本用眼科镊轻轻摄出，置于解剖镜下，用手术刀片将其腹部切开，再将单匹蚤体放入1.5 mL离心管中备用。根据QIAGEN试剂盒DNA提取步骤制备蚤DNA模板，并将模板置于-20 ℃保存。样本来源详见表1。

图1 青海省部分蚤种样本采集点信息 Fig.1 Sampling location of fleas used in present study in Qinghai

1.2PCR扩增 扩增体系：10×buffer 2.5 μL，dNTPs 0.5 μL，TaqDNA聚合酶0.15 μL，上下游引物各0.5 μL，模板2 μL，最后用dd H2O补齐反应体系至25 μL。扩增条件：94 ℃预变性4 min后进行40个循环，94 ℃变性 1 min，其中前10个循环的退火温度为55 ℃，后30个循环的退火温度为50 ℃，退火时间均30 s。72 ℃延伸40 s。扩增时选用通用引物扩增COI基因片段[8]，引物序列L1490(5′-GTCAACAAATCATAAAGATATTG-3′)和H2198(5′-AAACTTCAGGGTGACCAAAAAAT-3′)。将PCR扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，选取条带清晰样品送北京擎科生物技术有限公司进行双向测序(如图2)。

图2 PCR扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳图Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified products

1.3DNA序列分析 首先用Chromos软件观察测序峰图质量，选取峰图质量较高的测序结果在NCBI上运行BLAST程序进行序列同源性比较，以确保所获序列是目的序列。再用Clustal X软件[9]进行多重序列比对，将比对结果导入Mega 6.0软件[10]，基于Kimura-2-parameter模型[11]进行碱基组成计算和分析、序列信息位点检测、转换数与颠换数及其比值等。

2 结 果

2.1蚤类COI基因部分序列描述 共测得3总科5科11属19种蚤计68条COI序列，另外从GenBank中查询的蚤类同源序列经Mega 6.0软件进行序列组成分析，结果显示COI基因序列中保守位点有336个，变异位点有261个，简约信息位点有252个，自裔位点有9个。同时A、T、C、G碱基的平均含量分别为27.2%、39.7%、17.7%、15.4%，其中A+T含量(66.9%)远高于G+C含量(33.1%)，与目前已测线粒体DNA序列中较高的A+T含量现象相一致。

由表2可以看出，COI基因序列的碱基转换值明显高于颠换。T、C间的转换平均数是204，A、G间的转换平均数是137，TC转换大于AG间的转换。转换/颠换的平均值0.08，转换主要发生于A-G之间，颠换主要发生于T-A之间。第1位点R值最小，仅0.78，说明第一位点的替换多是同义替换，不会导致氨基酸的改变。

2.2NJ法构建系统树 运用Mega 6.0软件，基于Kimura-2-parameter模型，采用NJ邻接法构建柴达木盆地常见寄生蚤COI基因序列的NJ树(图3)，对NJ树进行内部分支检验与1 000次Bootstrap检验分析，来确定各支系的置信度。

表2 柴达木盆地蚤类COI基因碱基替换数Tab.2 Base substitutions on COI gene of fleas from Qaidam Basin

图3 基于Kimura-2-parameter模型构建蚤类NJ系统树Fig.3 A neighbor-joining phylogenetic tree of fleas based on Kimura 2-parameter model

3 讨 论

3.1遗传距离差异 柴达木盆地19种蚤的COI序列其平均遗传距离为16.1%，种内遗传距离0.01%～2.9%，种间遗传距离3%～15.4%，种间遗传距离显著大于种内遗传距离。种属间遗传距离如图4所示。

图4 柴达木盆地蚤类COI基因部分序列遗传距离差异分析Fig.4 Analysis of genetic distance on partial COI gene sequence of fleas from Qaidam Basin

3.2形态结果的修订 本研究中我们挑选了形态特征比较明显的非透明蚤标本做分子实验，即便这样，在分析和比对本研究的蚤类COI基因部分序列时，我们也发现一些种类的形态鉴别可能存在误定问题，尤其是雌蚤的鉴定结果。例如编号Z138的双蚤雌蚤(符合双蚤属属征：仅有胸栉，腹节背板有副鬃列，眼鬃位于眼的上方、触角窝的前缘，眼的前方有可见的幕骨拱，后足第5跗节4对侧蹠鬃、1对蹠鬃)，且第7腹板后缘较平，初鉴为原双蚤指名亚种；编号Z147、Z148的雌蚤在镜检时也符合双蚤属的属征，但第7腹板后缘具浅凹，下段不外斜，初步鉴定为方指双蚤。这3匹雌蚤均采自格尔木白尾松田鼠体表，因该地区未采到相应雄蚤，先暂以形态鉴定命名。在后续工作中发现这3匹蚤和GeneBank登录号为MG138278、MG138279的直缘双蚤指名亚种的雄蚤聚为一支，且置信度为99%。根据蚤类形态鉴别以雄性为主，雌性为辅的特性，所以我们在分子结果分析时结合现场鉴定结果、宿主和地区分布等综合考量，将这3匹雌蚤复鉴为直缘双蚤指名亚种。

实际工作应用中，一些雌蚤种一级的分类特征差异很小，我们在形态分类时只能鉴定到属，无法鉴定到种。若想细分，最好在同地区再次补点进行样本采集，以期获得该属雄蚤，看能否和雌蚤进行配对鉴定。如果雄蚤特征不匹配或现场补样条件不允许，可通过分子试验的COI基因数据在GeneBank基因库中比对后，再综合分子聚类结果和现场样本采集信息进行准确分类鉴定。

鉴于形态常规分类存在鉴定错判的可能，今后蚤类鉴定应以外部形态鉴定为主，结合分子鉴定结果，可更好地发现和纠正传统形态学鉴定中的错误，从而准确鉴别物种。

3.3系统树的构建和存在的问题 构建的系统树显示所有个体形成19个高支持度的单一分支，提示蚤种类应该有19种，这和蚤凭证标本复核结果大致一致，说明DNA条形码技术可用于蚤类的鉴定。

形态鉴别结果为秃病蚤田鼠亚种和秃病蚤指名亚种的COI基因序列在NJ树中却聚为一个分支，置信度100%，考虑亚种在形态鉴别中的很多问题和歧义等实际问题，笔者认为把这一分支直接定为种的阶元-秃病蚤，而不再往下细分更为合理些。

NJ树中长鬃双蚤和共和双蚤分支蚤种鉴定出现问题最多，暂时把这两个双蚤分支归为疑似长鬃双蚤、疑似共和双蚤类群。我们再三复核这两个分支的凭证标本，最后分析出现的问题原因大致有二，一是双蚤属雌蚤形态鉴定只能凭第7复板后缘凹陷的深浅及广度，差别细微，主观性较强，极易造成误鉴或只能粗略鉴定到属。二是雄蚤形态复鉴无误，但分子结果却和形态结果不相一致的问题。例如，1匹雄蚤形态鉴定为长鬃双蚤，复检透明标本后我们认为形态鉴别无误，但它却和共和双蚤聚为一支。关于这些形态极其相似、地理分布相近的蚤种分类，建议今后在形态分类基础上开展多基因分子标记，尤其是线粒体基因和核基因联合标记研究，以便精准分析种群遗传多样性和系统进化发育。

综上所述，尽管DNA条形码鉴定技术前景非常乐观，但目前分子鉴定技术的正确做法还是应以传统分类法为基础，保证分类物种为纯种且鉴别正确，在此基础上测定的COI基因序列才能作为该物种的DNA条形编码。并尽可能留存凭证标本，以供其他学者对形态数据和基因数据进行相关研究时做一参比。