一株猴源空肠弯曲菌的鉴定及其生物学特性分析

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空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni,C.jejuni)是世界范围内引起腹泻的最主要病原菌之一，尤其是对发达国家而言。空肠弯曲菌可造成腹痛、水泻、血便、发烧、恶心、呕吐等不同程度的病症，虽多为自限性疾病，但对年幼的儿童、老年人以及免疫抑制人群可能具有致命性。此外，部分人群可因感染弯曲菌而导致包括吉兰巴雷综合征(GBS)、反应性关节炎(ReA)、肠易激综合征(IBS)等多种后遗症，给人的健康安全带来巨大威胁[1-2]。

空肠弯曲菌是重要的食源性病原菌，其宿主范围极为广泛，包括禽类、人、牛、羊，犬、猫、昆虫等，非人灵长类动物对空肠弯曲菌也较为敏感，能产生不同程度的腹泻[3]，但其传播规律并不明确[4]。周勤[5]等人曾对我国健康实验猴弯曲菌感染进行调查，结果表明弯曲菌病在实验猴类中普遍存在，但并不表现临床症状，调查中并未对感染猴群的菌株进行深入的生物学特性分析。Koga[6]等人对购自亚洲国家的猕猴进行弯曲菌检测，发现中国来源的猕猴弯曲菌总检出率为15%，空肠弯曲菌检出率虽仅有2.5%，但根据药敏实验发现非人灵长类动物中有多重耐药的弯曲菌，这从人兽共患病角度考虑是一个值得关注的生物安全警示。本实验室在对猴群肠道致病菌进行流行病学调查过程中发现某腹泻实验猴群志贺菌和沙门菌检出阴性，但弯曲菌检出阳性。因此，我们对从一株分离自正处于腹泻期的实验猴的肛拭样中的空肠弯曲菌分离株进行鉴定和生物学特性分析，以期通过对流动性较小的实验猴群的流行病学监测和相应的空肠弯曲菌分离株的研究，探究空肠弯曲菌在猴群中的传播规律及其致病机理。

1 材料和方法

1.1主要材料 空肠弯曲菌 NCTC11168 由遵义医学院孙万邦教授惠赠；Balb/c小鼠购自扬州大学比较医学中心；头孢哌酮购自LKT公司；两性霉素B购自Wako公司；马尿酸钠购自国药集团；茚三酮购自Solarbio公司；改良CCDA培养基购自OXOID公司；Muller Hinton(MH)液体培养基购自BD公司；NH鉴定卡购自德国梅里埃公司；其余常规试剂均为国产或进口分析纯产品。

1.2主要仪器 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(BRUKER)、VITEK-2 Compact 30全自动微生物鉴定与药敏分析系统(Bio Mérieux)、环境扫描电子显微镜为扬州大学测试中心仪器。

1.3 细菌鉴定

1.3.1细菌多重PCR鉴定、纯化 猴源分离株经初步纯化，传代培养后挑取菌苔于SW中，金属浴99 ℃加热10 min，获得水煮DNA模板，按何蕊[7]的方法进行多重PCR鉴定是否为空肠弯曲菌。将初步鉴定的空肠弯曲菌挑取单菌落传代于CCDA上，培养24 h后，再挑取单菌落纯化3次。

1.3.2NH生化鉴定实验 用CCDA复苏猴源分离株，传代后用0.45% NaCl溶液收获，按说明书调浊度至3.0，用NH鉴定卡在VITEK 2鉴定系统进行检测，6 h后获取鉴定结果。

1.3.3马尿酸钠水解实验 参照国标法进行马尿酸钠水解实验：挑取细菌于400 μL 1%马尿酸钠溶液中，37 ℃水浴2 h后，沿壁缓缓加入200 μL 3.5%茚三酮，37 ℃水浴10 min，观察是否有颜色变化，出现深紫色者为阳性，淡紫色或无颜色变化为阴性，用NCTC11168做阳性对照，沙门菌做阴性对照。

1.3.4质谱鉴定 复苏分离株并传代。仪器校准后，挑取新鲜的猴源分离株菌落，用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)进行指纹图谱法鉴定细菌，NCTC11168做阳性对照菌株。

1.3.5电镜观察 用PBS收集生长中期的猴源分离株，2 000 r/min离心5 min，收集菌体沉淀，用2.5%戊二醛溶液轻柔重悬，4 ℃下固定2 h。取菌悬液滴于铜网上，室温静置10 min，然后用滤纸吸去样品悬液，再在铜网上滴加一滴磷钨酸，负染2 min，用滤纸吸去负染液，于室温条件下干燥20 min后进行电镜观察。在扬州大学测试中心进行透射电子显微镜观察细菌形态，NCTC11168做对照菌株。

1.4生长曲线测定 复苏菌株并传代培养至生长对数期，用MH液体培养基收获，调OD600为1.0，稀释100倍，OD600为0.001。加1 mL稀释后的菌液于24孔板中，2个复孔，42 ℃，130 r/min，微需氧条件下培养，每3 h取一块24孔板检测OD600，共检测27 h。与NCTC11168进行比较，并设纯MH液体培养基为阴性对照。

1.5运动力检测 经复苏、传代后，用PBS收集生长中期的细菌，调OD600至0.8。用接种针蘸取菌液，垂直穿刺于0.4%MH半固体培养基中，42 ℃，微需氧条件下培养24 h，观察运动圈大小。

1.6小鼠体内定殖实验 采集6～8周龄雄性清洁级Balb/c小鼠新鲜粪便，用PBS悬浮后,取100 μL涂布于含二抗的CCDA平板[8]中，42 ℃微需氧培养24 h，无细菌生长，表明该小鼠体内无弯曲菌，且在该条件下小鼠体内杂菌不生长。提前15 min灌胃200 μL 5% NaHCO3中和胃酸，用无菌PBS收集生长中期的细菌，调OD600至1.0，取200 μL菌液进行灌胃，每组3只，空白对照组用等量PBS灌胃。每天检测粪便中是否带菌，攻毒后第7天，脱颈椎致死小鼠，无菌采取肝、脾，均质后取100 μL原液涂布计数。同时采集十二指肠、空肠、回肠、盲肠，均质后10倍倍比稀释，用二抗CCDA平板10 μL计数。

2 结 果

2.1多重PCR鉴定 猴源分离株多重PCR鉴定结果显示在约857 bp处和589 bp处分别有16SrRNA基因条带和mapA基因条带，与阳性对照一致，鉴定为空肠弯曲菌，将该空肠弯曲菌分离株命名为M166。结果见图1。

M: DL 2000, 1:M166, P:阳性对照, N:阴性对照图1 M166的PCR鉴定Fig.1 PCR identification of C.jejuni isolation M166

2.2生化鉴定结果 生化鉴定 M166在VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定仪检测结果表明M166有99%的可能性为空肠弯曲菌。参照国标法判定结果，M166的马尿酸钠水解实验呈现深蓝紫色，和NCTC11168结果一致(见图2)，为阳性，符合空肠弯曲菌的生化特性。

图2 马尿酸钠水解实验Fig.2 Hydrolyzation of sodium hippurate

2.3质谱鉴定 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪对M166质谱鉴定结果显示：最高评分为2.321，大于2.3，鉴定结果十分可信，其他评分分别为2.202、2.161、2.142，均鉴定到种，结果可信，该菌鉴定为空肠弯曲菌Campylobacterjejuni。

2.4电镜形态观察 M166投射电镜观察结果如图3A所示，菌体呈现弯曲、螺旋形态，菌体长度多为1～2 μm，有1～2个不等的螺旋，是典型的弯曲菌形态，且约有90%菌体含有鞭毛(键头指向处)。但标准株NCTC11168结果如图3B所示，菌体形态近乎杆状，仅约有30%菌体有鞭毛。

图3 透射电子显微镜结果Fig.3 TEM of C.jejuni

2.5生长曲线 生长曲线每3 h检测1次，共27 h，图4表明M166和NCTC11168的生长趋势一致，生长对数期在前12 h，15 h后OD值继续上涨，但24 h后进入平台期。M166生长速度明显慢于NCTC11168，且生长峰值不如NCTC11168高。

图4 M166和NCTC11168生长曲线Fig.4 Growth curve of M166 and NCTC11168

2.6运动力 由图5可知，M166的运动圈显著大于NCTC11168，而NCTC11168表现出微弱的运动力，表明M166的运动力较强，具有丰富的有活力的运动装置。

图5 M166和NCTC11168运动力检测Fig.5 Motility of M166 and NCTC11168

2.7小鼠体内定殖结果 小鼠粪便载菌检测结果显示NCTC11168感染组仅在接种后第1天有分离到空肠弯曲菌，此后6 d均无空肠弯曲菌分离出，属于一过性排菌，但M166感染组能持续7 d排菌，且保持较高排菌量，可达105CFU/g。第7天取小鼠脏器分离细菌，在肝、脾部位均无细菌检出，但各肠道部位分离结果如图6所示，NCTC11168和空白对照组在肠道中均无细菌检出，与粪便分离结果一致。M166感染组十二指肠、空肠、回肠、盲肠均能检测到空肠弯曲菌，对数载菌量分别可达3.09±0.47，3.01±0.84，3.80±0.46，5.63±0.34 CFU/g。细菌分离并未见其他杂菌菌落生长。

图6 小鼠肠道内空肠弯曲菌载量Fig.6 Load of C.jejuni in mouse intestinal tracts

3 讨 论

经过多重PCR、VITEK 2生化分析、马尿酸钠水解实验、MALDI-TOF-MS质谱鉴定、电镜形态观察，证明猴源分离株M166是空肠弯曲菌。VITEK 2生化鉴定空肠弯曲菌，推荐结合马尿酸钠水解实验。马尿酸钠水解实验有两种检测方法，分别为茚三酮法和三氯化铁法，但茚三酮法更为快速，也是国家标准中推荐的方法。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)作为一种新型的利用蛋白质谱学生物快速检测和鉴定技术得到了较快的发展，Martiny等人[9]证明利用MALDI-TOF-MS鉴定空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的准确性可达100%，较API Campy系统和Vitek 2 NH鉴定卡准确程度更高。本实验利用MALDI-TOF-MS微生物质谱仪鉴定弯曲菌的结果也表明该方法是准确、快速、重复性高的弯曲菌的鉴定方法，但因弯曲菌生长缓慢，菌落较小，多刮取菌苔上样，故分离株需要纯化后进行鉴定。

生长曲线测定取始终处于同一培养条件下不同时间点的菌液检测OD600，避免氧压、温度反复变化引起的应激。M166和NCTC11168的生长趋势一致，15 h后OD值继续上涨，可能是进入二次生长或者是由于代谢产物增加。运动力和鞭毛关系密切，M166的运动力显著强于NCTC11168，提示NCTC11168的鞭毛活力不强或者鞭毛数量较少，而透射电镜结果显示有鞭毛的M166菌体数比NCTC11168多。而鞭毛合成是一个十分复杂并耗能的过程[10]，M166表达、组装鞭毛，消耗较多能量物质，限制了菌体的增殖，可能是导致M166在有限的MH培养基中生长较缓慢、生长峰值不高的原因。此外，电镜观察结果显示NCTC11168为鞭毛缺陷的直杆菌，表明标准株发生了表型变异，Frirdich等人证实Pgp1突变株可导致空肠弯曲菌丧失弯曲、螺旋形态，呈现杆状形态[11]，Pgp2也与此相关[12]，说明肽聚糖修饰影响空肠弯曲菌表型，螺旋形态变成杆状可一定程度上降低运动力[13]。鞭毛基因经测序发现是易变的[14]，鞭毛出现缺陷可能是由于发生了基因变异。而M166具有典型的弯曲菌形态，生化特征稳定，且运动性能活泼，是一株表型典型的空肠弯曲菌分离株。

由于猴类动物的菌株回归实验受限较多，空肠弯曲菌一直没有稳定的动物致病模型，但小鼠常用来做定殖评价模型。根据流行病学分析表明雄性动物对弯曲菌比雌性更易感，Walter等人[15]分析德国2001-2013年间细菌感染和性别的关系以及Kuhn等人[16]分析丹麦弯曲菌病和性别的关系中都表明男性发病率更高，故选用雄性小鼠进行定殖实验。NCTC11168并不能在小鼠肠道中稳定定殖，仅有一过性排菌现象，这与文献报道用于测序的NCTC11168的定殖能力差的结果相符，但同时M166能在Balb/c小鼠各肠道内稳定定殖，且排菌期超过7 d，盲肠载菌量超过105CFU/g，虽然不如在鸡盲肠中的定殖水平(108～1010CFU/g)高[17]，但也证明小鼠盲肠是M166最主要的定殖部位，这说明M166是一株有较强定殖能力的空肠弯曲菌。定殖能力强是M166在实验猴肠道中定殖并引起腹泻的重要前提。虽然第一株完成全基因组测序的空肠弯曲菌是NCTC11168[14]，但后期实验证明其肠道定殖能力差。而NCTC11168最原始菌株具有定殖能力，但是各实验室的标准株多为在复苏、培养过程中得到是形态发生改变和/或运动力、定殖能力减弱的变异株[13,18]。鉴于空肠弯曲菌基因组的易变性，M166在实验室保存、传代培养过程中，是否会出现定殖能力减弱的变异株需要继续观察。

在标准株NCTC11168普遍发生变异、致病性减弱的情况下，猴源分离株M166是对空肠弯曲菌病研究的重要生物材料补充，而其生物学特性、毒力和传播规律也有待下一步深入研究，以期能有助阐明空肠弯曲菌的致病性，指导对空肠弯曲菌的防控。