敲低环状RNA-circFBLIM1抑制人胃癌细胞生长与转移

张志伟(通信作者)

421001南华大学医学院肿瘤研究所1；肿瘤细胞与分子病理学湖南省重点实验室，湖南衡阳

421000南华大学附属第一医院2，湖南衡阳

环状RNA(circRNAs)是一种天然存在的非编码RNA，目前受到越来越多的关注。circRNAs缺乏5'帽或3'尾，而是形成共价闭合的连续环状结构，从而使其对RNaseR酶活性具有抗性，因此比线性RNA更稳定。在二十多年前，Nigro等首次发现了circRNA，但它被认为是分子吸虫或异常RNA剪接的人工制品，无任何功能[1]。直到近年来，随着快速发展的高通量RNA测序(RNA-Seq)技术和生物信息学方法，对circRNAs进行了广泛的研究，证实了circRNA在肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭中具有重要作用，可能可作为癌症治疗所需的新型生物标志物和治疗靶点[2]。目前关于circFBLIM1在胃癌中的生物学功能尚不清楚。本研究采用MTT、Taswell侵袭实验检测circFBLIM1在人胃癌MGC-803细胞中的生物学行为，为进一步阐明胃癌发生、发展的分子机制提供实验依据。

资料与方法

实验材料：人胃癌MGC-803细胞，由本室保存；si-circFBLIM1、si-control、Transwell小室、Lipofectamine 2000、MTT粉均购于美国Invitrogen公司。

实验方法：(1)MTT实验：培养人胃癌MGC-803细胞，将si-circFBLIM1与si-control转染质粒按转染说明分别转染于MGC-803细胞中。细胞分为si-circFBLIM1与si-control组。分别取上述两组转染后的MGC-803细胞接种于96孔板中，每组设5个复孔，培养至临近饱和，每孔加灭菌MTT液(5 mg/mL)20 μ L，孵育4 h后取出，每孔中加入DMSO 150 μL，低速振荡10 min，选择570 nm波长在酶标仪上测定各孔吸光值，记录结果，实验重复3次。(2)Transwell侵袭实验：细胞培养与分组同MTT实验。在transwell小室中铺加8 μL稀释好的基质胶，过夜形成基质膜。取100 μL即含1×105个细胞/mL的细胞稀释液，接种于transwell小室上层，下腔加500 μL含20%FBS的培养液后，置于37℃温箱中孵育36 h，取出，用棉签擦弃小室上层未迁移的细胞，PBS液轻洗，4%多聚甲醛固定、结晶紫染色下层穿出细胞，PBS液洗，倒置，晾干。光学显微镜下观察并摄像，随机选取4个高倍视野进行细胞计数，取平均值，实验重复3次。

统计学处理：数据采用SPSS 16.0软件分析；计量资料以(±s)表示，采用t检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

敲低circFBLIM1对人胃癌MGC-803细胞增殖的影响：MTT结果显示，在MGC-803细胞中，转染si-circFBLIM1 24 h、48 h、72 h后OD值分别为(0.461±0.002)、(0.586±0.005)、(0.672±0.008)，si-control组MGC-803细胞OD值分别为(0.583±0.004)、(0.738±0.010)、(0.841±0.018)，与si-control组相比，差异均有统计学意义(P＜0.05)。提示在MGC-803细胞干扰circFBLIM1后能抑制癌细胞的增殖。

敲低circFBLIM1对人胃癌MGC-803侵袭的影响：Transwell结果显示，si-circFBLIM1组穿过基质胶的MGC-803细胞数量为(112±6)，与si-control组的(184±13)相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。提示在MGC-803细胞干扰circFBLIM1后能抑制癌细胞的侵袭。

讨 论

越来越多的证据表明，circRNA与多种人类疾病相关，如动脉粥样硬化、阿尔茨海默病、帕金森病、糖尿病等，尤其是肿瘤[3]。circRNA具有丰富高度组织表达特异性和跨物种保守的特点，在唾液、血液和外来体中稳定表达，还具有组织、发育阶段的特异性等特征，满足有希望的癌症生物标志物的要求。此外，因circRNA数量相对较少，故比miRNA更容易被检测到。此外，通过RT-PCR和原位杂交测试circRNA的方式比通过抗原-抗体反应检测蛋白质更具有敏感性和特异性。因此，circRNA可能具有作为潜在肿瘤生物标志物的优势。

目前研究已证实，一些circRNA被认为是潜在的生物标志物。例如，circ-100855在喉鳞状细胞癌(LSCC)组织中主要上调和circ-104912显著下调，并且它们的表达与肿瘤分期和颈部淋巴结转移显著相关，这意味着T3～4期，颈部淋巴结转移或晚期临床分期的患者具有更高的has-circ-100855表达和更低的has-circ-104912表达。这也提示circ-100855与circ-104912是LSCC发生中潜在的新的生物标志物[4]。类似的，在胃癌中下调的circ-002059与远处转移、TNM分期相关，对胃癌的诊断发挥重要作用[5]。此外，has-circ-0000-190、has-circ-0000096和circPVT1也是有希望的胃癌生物标志物。

circFBLIM1即has-circ-0010090(chr1：16084668-16113084)，其来源于FBLIM1基因(1p36.21)。目前circFBLIM1的生物学功能鲜见报道。为了评估circFBLIM1在胃癌中的生物学功能，我们通过转染si-circ FBLIM1的方式来干扰胃癌细胞系MGC-803中circFBLIM1的表达。通过MTT实验，我们发现在胃癌细胞系中干扰circFBLIM1的表达后，胃癌细胞的增殖能力显著被抑制。Transwell实验结果显示，通过抑制circFBLIM1的表达，胃癌细胞穿过transwell膜的能力显著下降，提示侵袭能力明显被抑制。目前，circFBLIM1在胃癌中的研究仍处于起始阶段，其分子调控机制不明。继续深入circFBLIM1在胃癌中的研究，将有助于我们更好地了解胃癌进展，为胃癌新生物标志物的确定和潜在治疗靶点的挖掘提供新思路。