全自动发光免疫分析仪性能评价技术研究

王 军, 代蕾颖, 杨 忠, 赵丙锋, 李 正, 王会如

(北京市医疗器械检验所体外诊断检验室, 北京 101111)

1 引 言

自动化的发光免疫分析仪越来越广泛地应用于医学检验[1-3]。全自动发光免疫分析仪研发制造技术门槛高，涉及光、机、电、软、液路、温控、免疫分析等多方面的综合技术，系统结构复杂、控制时序要求严格、运行可靠性和精度要求高[4-5]。由于仪器结构复杂，相应地对其进行性能评价和质量检测也有相当的难度，主要体现在：不同厂家的仪器，原理、结构不一样，很难建立统一的评价标准；仪器全封闭、自动化，从工程学上进行操作和干预比较困难；核心评价技术，例如标准光源、发光剂等，被少数国外大企业掌握。基于以上原因，目前企业、监管部门、使用单位基本采用仪器配套用发光免疫试剂盒来评价检测系统(仪器+试剂盒)的整体性能[6-10]。这种评价方法过度依赖配套试剂盒，不能准确反映仪器本身的性能，并且各个仪器所配试剂不同(激素、血药、肿瘤标志物、病原体……)，得出的指标也缺乏可比性。

全自动发光免疫分析仪的关键模块包括加样系统、孵育系统、清洗系统和检测系统，本研究对各个模块分别建立了可行的、标准化的评价方法。本研究建立的评价方法适用于化学发光、电化学发光、荧光等不同发光原理的仪器，也适用于酶促发光和非酶促发光不同反应类型的仪器。

2 材 料

2.1 主要仪器

全自动发光免疫分析仪：西门子Centaur XP、Centaur XPT、Centaur CP、Centaur Atellica、IMMULITE1000、IMMULITE2000、Dimension EXL；雅培ARCHITECT i2000sr；罗氏cobas e411、cobas e601、cobas e801；贝克曼库尔特 DxI、Access 2；希森美康 HISCL-800、HISCL-5000；赛默飞世尔Phadia 250；生物梅里埃 VIDAS 3；迈克IS 1200、i3000；利德曼CI1000；迈瑞CL-1000i、CL-2000i；迪瑞CM-180；博奥ChemLiteTM 1200；新产业Maglumi 800、Maglumi 4000；安图AUTOLUMO A2000、AUTOLUMO A2000 Plus；科美LiCA 500、CHEMCLIN 1500。

福禄克f50d或其他分辨率不低于0.1 ℃的温度测量仪。

梅特勒bs210s或其他分度值为0.01 mg的电子天平。

日立U-3010型紫外分光光度计。

MilliQ Advantage超纯水机。

2.2 参考光源

参考光源为发光二级管(LED)，通过调节LED驱动电流的DA值，可获得不同光强的光。

2.3 试剂

橙黄G(Orange G)：CAS号1936-15-8。

发光剂：分为酶促和非酶促两种，酶促发光剂由游离酶液和底物液组成，非酶促发光剂主要成分为发光标记物和缓冲液。

空白样品：待测物为零浓度的样品液。

人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)试剂盒及配套校准品。

高浓度β-HCG临床样品：浓度超过105mIU/mL。

3 测试方法

3.1 反应区温度控制的正确度和波动度

将全自动发光免疫分析仪反应区温度设置为37 ℃，待稳定后，使用温度测量仪进行测量，每隔30 s测定一次温度值，测定时间为10 min。计算温度测量值的算术平均值，算术平均值与设定值之差为测量偏倚，测量最大值与最小值之差的一半为温度波动度。

3.2 加样正确度与精密度

准备可防水分挥发的适当容器，在电子天平上调零后放到合适位置，控制全自动发光免疫分析仪的试剂针或样品针，向该容器中加入规定量除气超纯水，再在电子天平上称量其增加质量，以该质量除以当时温度下纯水的密度得到实际加入的体积。每种规定加入量重复测量20次，超纯水需提前置于恒温、恒湿的实验室内平衡数小时。以加样体积的变异系数表征加样精密度，以加样体积的相对偏倚表征加样正确度。

3.3 光检测装置部分

3.3.1 仪器噪声

3.3.2 发光值的线性

测试发光值的线性有下列两种方法：

(1)发光剂法。将光源检测专用高值发光剂用稀释液按比例稀释成至少5个样品，混合均匀后用分析仪检测发光值，每个样品重复测定3次。计算各样品3次测量值的算术平均值，以稀释比例为自变量，以测定结果均值为因变量进行线性拟合，并计算线性回归的相关系数(r)。

(2)参考光源法。在分析仪上测试参考光源，通过调节LED驱动电流的DA值，可获得不同光强的光，以标定值为自变量，以分析仪实际测量所得的发光值为因变量进行线性拟合，并计算线性回归的相关系数。

3.3.3 发光值的精密度

可选用发光剂法或参考光源法进行试验。用分析仪对在线性范围内的高、低2个水平的参考光源或发光剂进行测试，连续测试10次，记录发光值，计算发光值的变异系数，用变异系数表征发光值的精密度。

3.3.4 发光值的稳定性

可选用发光剂法或参考光源法进行试验。待分析仪开机处于稳定工作状态后，用在线性范围内的高、低2个水平的参考光源或发光剂进行测试，重复测试3次，记录发光值，计算测定结果的算术平均值I0。过4 h和8 h再分别上机重复测试3次，计算测定结果的算术平均值I1和I2，以I0作为基准值，计算4 h和8 h的相对偏倚(a，%)，用相对偏倚表征发光值的稳定性。

3.4 携带污染

4 结 果

4.1 反应区温度控制的正确度和波动度

免疫反应的完成需要在一定温度下进行，因此仪器要对反应区温度进行精密控制，该项考察的是仪器孵育系统的性能。使用温度测量仪对8个型号的仪器进行了温度采集，温度控制准确度和波动度结果见表1。可以看出，温度控制正确度均在(37±0.5) ℃，波动度均不超过0.5 ℃。参考全自动生化分析仪行业标准[11]，全自动生化分析仪温度控制正确度要求不超过0.3 ℃，波动度不超过0.2 ℃。免疫反应对温度要求没有生化反应严苛，温度控制正确度不超过0.5 ℃、波动度不超过0.5 ℃应能满足临床要求，因此初步判定这8款全自动发光免疫分析仪温度控制合格。

表1全自动发光免疫分析仪反应区温度控制结果

Tab.1 Testing result of temperature control of automatic luminescence immunoassay analyzers

仪器序号温度控制正确度/℃温度控制波动度/℃10.300.1420.430.163-0.050.044-0.030.0550.500.0060.300.1070.000.4080.370.20

注：表中仪器序号与条款2.1不对应，也与下面各表不对应。下表同。

4.2 加样正确度与精密度

全自动仪器的样本处理、试剂处理均为批量化操作，加样模块的精确设计和加工制造对于提高操作效率、加强实验精度非常关键。经调查，由于市面上各型号仪器的试剂针、样品针的加样量程差别很大，无法设定统一的加样考核点，因此本研究对仪器标称的样品最小加注量和最大加注量、试剂最小加注量和最大加注量都进行了测试。

采用称量法对27个型号的加样模块进行了测试，结果见表2。表2可印证，各型号仪器的样品针和试剂针加样量程差别大，样品针最小加注量从5 μL到40 μL，最大加注量从20 μL到300 μL，试剂针最小加注量从5 μL到50 μL，最大加注量从47 μL到450 μL。无论是样品针还是试剂针，当加注量>10 μL时，大部分仪器能满足偏倚不超过10%，CV不超过3%；当加注量>50 μL时，大部分仪器能满足偏倚不超过5%，CV不超过2%。从表2可看出，加样量越小，偏倚和CV越大，这是因为加样量越小，对仪器要求越高，技术实现难度越大。综合起来，建议7号、15号、22号、27号仪器应对加注装置进一步改进，以达到其声称的加样量要求。

表2 全自动发光免疫分析仪加样模块测试结果

由于全自动发光免疫分析仪为全封闭仪器，在采用称量法测试加样模块精度时，有的仪器不能实现仪器开盖、加纯水作为待测样品或试剂、中断加样操作等干预步骤，实施称量法较为困难。在此情况下，本研究开发了第二种方法即比色法。比色法的原理是色素溶液的稀释比例与吸光度成线性关系。本研究采用橙黄G色素液，将其作为样品或试剂，控制仪器按设置的加注量加注到反应杯中，然后将杯中橙黄G全部回收，在分光光度计波长478 nm下测试其吸光度，与理论吸光度进行比较，通过计算，得出仪器加样的精度。与称量法相比，色素法操作相对繁琐，但其具有受环境影响小的优点，尤其适用于加注量小的情况。

4.3 光检测装置部分

4.3.1 仪器噪声

仪器噪声大小直接关系到仪器的检测灵敏度，噪声越大，检测的灵敏度就越低。免疫检测为超微量分析，因此要求仪器的噪声越小越好。表3为检测器噪声检测结果，结果显示，化学发光仪、电化学发光仪、荧光免疫仪检测的发光信号是不同的，并且发光强度是一个相对值，仪器可以进行调整。各个厂家对仪器噪声规定值不同，实际测试值也不同，但均能满足各自规定。

表3全自动发光免疫分析仪噪声测试结果

Tab.3 Testing result of noise of automatic luminescence immunoassay analyzers

仪器序号测量单位企业规定测试结果噪声1相对光子强度(Relative light unit,RLU)3001502RLU6001143RLU1 5004054RLU1 0003325RLU500996RLU100317Counts4503008RLU300329RLU60015010RLU1 50029211RFV500438

4.3.2 发光值的线性

发光值的线性大小直接反映仪器的测量范围。由于仪器原理、结构、操作可行性等因素，本研究对发光值线性的测试采用了2种方法，参考光源法和发光剂法。

目前，发光仪所使用的参考光源大多采用发光二级管(LED)，通过调节LED驱动电流的DA值，可获得不同光强的光。参考光源在制作、标定上有一定技术难度，所以采用参考光源进行发光仪光学系统检测的厂家还较少[12]。大多数厂家采用发光剂法[13]。发光剂分为酶促和非酶促两种，酶促发光剂由游离酶液(如碱性磷酸酶)和底物液组成，不同体积量的游离酶液与固定体积量的底物液充分混合后，将会发出不同强度的光强。非酶促发光剂主要成分为发光标记物(如异鲁米诺)和缓冲液。使用时，用稀释液将酶液或标记物稀释成不同浓度梯度，再与底物液混合，发出不同强度的光强，用来测试发光仪的性能。

发光值线性测试，共测试了11个不同型号的仪器，其中1个型号的仪器采用参考光源进行测试，8个型号的仪器采用发光剂进行测试，还有2个型号的仪器同时采用两种方法进行测试，结果见表4。从表中可以看出，仪器的线性范围均不小于3个发光值数量级，有的甚至达到6个数量级，线性相关系数都达到0.99以上。2个型号的仪器同时采用两种方法进行测试，结果接近，基本说明两者方法是等效的。

表4全自动发光免疫分析仪发光值线性结果

Tab.4 Testing result of luminescence linear of automatic luminescence immunoassay analyzers

仪器序号测试方法线性范围(RLU)r1参考光源法103～1060.999 992发光剂法102～1050.999 9963发光剂法102～1050.9984发光剂法103～1050.999 65发光剂法102～1060.999 86发光剂法102～1050.999 97发光剂法102～1050.999 88发光剂法103～1060.999 19发光剂法103～1070.99810参考光源法103～1060.999 9发光剂法103～1060.997 511参考光源法102～1070.999 2发光剂法102～1070.999 2

4.3.3 发光值的精密度

对发光值的精密度测试，选取了接近厂家标称的测量范围的上限和下限两个点，具体结果见表5。测量范围下限点的CV要高于测量范围上限点的精密度，最大值达到3.8%。目前行业内对发光仪检测模块的精密度要求是CV不超过3%，因此建议1号、3号仪器要进一步改进。

表5全自动发光免疫分析仪发光值精密度结果

Tab.5 Testing result of luminescence precision of automatic luminescence immunoassay analyzers

仪器序号测试方法测量范围下限的精密度CV/%测量范围上限的精密度CV/%1参考光源法3.10.22参考光源法2.90.13发光剂法3.80.54发光剂法1.71.35发光剂法2.41.66发光剂法1.41.27发光剂法2.40.68发光剂法1.30.59发光剂法1.00.510发光剂法1.61.511参考光源法0.80.05发光剂法0.80.7

4.3.4 发光值的稳定性

对发光值的稳定性测试，同样选取了接近厂家标称的测量范围上限和下限两个点，具体结果见表6。测量范围下限点的偏倚要高于测量范围上限点的偏倚，最大值达到8.0%。目前行业内对发光仪检测模块的稳定性要求是偏倚不超过5%，因此建议1号、5号仪器要进一步改进。

4.4 携带污染

携带污染主要表现为不同浓度样品间连续测试的相互影响，特别是含量高的样品对含量低的样品所产生的影响，考察的是仪器清洗系统的性能。本研究对6个不同型号的仪器进行了携带污染测试，结果见表7。携带污染率差别较大，从0.8×10-6～54×10-6。对于部分线性范围不太宽的项目，携带污染对检测系统引入的总误差贡献很小，但是对于乙肝表面抗原(HBsAg)、HCG这类测量范围较宽的项目，如果携带污染大，就很容易对低值的阴性样品造成干扰，可能造成样品检测成假阳性[14]。本研究中将携带污染率设置为10×10-6，10×10-6可认为是一个门槛，满足该要求后95%的临床检测项目都可满足临床要求。按照该要求，建议5号、6号仪器要进行进一步改进。

表6全自动发光免疫分析仪发光值稳定性结果

Tab.6 Testing result of luminescence stability of automatic luminescence immunoassay analyzers

仪器序号测试方法测量范围下限的稳定性a/%测量范围上限的稳定性a/%1参考光源法6.70.42参考光源法1.2/3发光剂法 2.70.14发光剂法4.02.85发光剂法8.03.76发光剂法3.81.47发光剂法1.71.08发光剂法2.00.99发光剂法 /2.110发光剂法 2.70.911参考光源法1.50.1发光剂法1.41.2

表7全自动发光免疫分析仪携带污染结果

Tab.7 Testing result of carry-over of automatic luminescence immunoassay analyzers

仪器序号携带污染率K/10-610.8243645521654

5 讨 论

全自动发光免疫分析仪的关键模块包括加样系统、孵育系统、清洗系统和检测系统，本研究从全自动发光免疫分析仪的结构和特点出发，建立了统一的评价方法。采用本研究建立的方法，完成了对市面上主流的15家生产企业生产的30个不同型号的全自动发光免疫分析仪的性能评价，基本证明了该方法的适用性和可操作性。本研究主要贡献体现在：

(1)建立了全自动发光免疫分析仪可行的、统一的、标准化的评价方法。

本研究对加样系统、孵育系统、清洗系统和检测系统(噪声、线性、精密度、稳定性)分别建立了检测方法，结合全自动发光免疫分析仪的特点，对加样系统同时建立了称量法和比色法两种方法，对检测系统同时建立了参考光源法和发光剂法两种方法。本研究建立的检测技术适用性强，能适用于化学发光、电化学发光、荧光免疫等不同发光原理的仪器，也适用于酶促发光和非酶促发光不同反应类型的仪器。

(2)完成了对市面上主流的全自动发光免疫分析仪的摸底测试。

用本研究建立的方法，对市面上主流的15家生产企业生产的30个不同型号的全自动发光免疫分析仪进行了性能评价，基本结论为：孵育系统，所有仪器均能满足要求；加样系统，少数仪器不能达到其声称的最小加注量；检测系统，所有仪器均能满足噪声和线性要求，少数仪器不能达到精密度和稳定性要求；清洗系统，某些仪器的携带污染率不能达到要求。数据显示，全自动发光免疫分析仪还有一定的质量提升空间。

(3)促进企业开发参考光源、发光剂等检测工装。

本研究开展前，只有少数企业具备参考光源或发光剂。在建立全自动发光免疫分析仪检测方法过程中，国内外企业积极参与。通过对方法的反复讨论和验证，拓宽了思路，促使企业去开发检测设备和工装，特别是参考光源、发光剂等重要工装的开发，解决了全自动发光免疫分析仪评价的核心技术障碍，从而也促进了产品的质量提升。

目前各厂家用参考光源和发光剂尚不能实现标定和计量学溯源，因此本研究后续工作设想是与计量部门合作，开发参考光源和发光剂的标准物质，从而进一步完善发光免疫分析仪的检测方法，促进免疫诊断结果的溯源和量值准确传递。