近红外荧光传感法测定中药材中赭曲霉毒素A

曾云龙， 赵 敏， 张 敏， 易守军， 唐春然， 夏晓东, 贺超才

(1. 湖南科技大学 化学化工学院， 理论有机和功能分子教育部重点实验室， 湖南 湘潭 411201;2. 长沙职业技术学院， 湖南 长沙 410217)

1 引 言

植物的植株、种子和茎块通常是中药材的主要组成部分，是中医治疗疾病的物质基础。然而植物中药材在生长、收获、运输、贮存等环节中极易受到霉菌污染[1-2]，药材受到赭曲霉、纯绿青霉和碳黑曲霉污染后，它们的代谢产物中存在高毒性赭曲霉毒素A(OTA)，致使中药材中OTA污染普遍存在[3-7]。OTA具有致癌、致畸、致突变、肾毒性等毒性[8-9]。服用含有微量OTA的中药，一般不会致病患者出现急性中毒现象，但它能在人体内积蓄，对人造成慢性毒害，引发各种疾病。近年来，人们发现中药对一些重大疾病和慢性病的疗效较西药更为显著，且毒副作用较西药低，因此，欧美等发达国家开始研究和使用中药。但中药(材)普遍受到真菌毒素污染，由此引发的安全性已受到国内外的高度重视，欧盟规定辣椒、肉豆蔻、干姜、姜黄及其混合物中OTA的限量为15 μg·kg-1，甘草根的浸渍物中OTA 限量为20 μg·kg-1。我国是中草药的发源地，目前大约有12 000种药用植物，为了确保药用安全并加速中药国际化和现代化，对中药材中OTA进行监测具有重要意义。

目前，中药材中痕量OTA检测方法主要有色谱法和酶联免疫法[10-12]等。酶联免疫法存在抗原/抗体和酶的价格高、且易失活而失效的问题；色谱法及色-质联用法技术要求高、所需试剂纯度高、仪器设备昂贵、分析成本高，不易普及。因此，非常有必要发展简单、快速、灵敏、准确的中药材真菌毒素检测方法。碳量子点碳源丰富，制备方法简单、环保，具有很好的光学特性和生物相容性，广泛应用于活体成像、医疗诊断和化学生物传感等领域[13-15]。通常碳量子点荧光发射在400～550 nm可见光范围，以其作为探针，易受内源性物质荧光的干扰，如果以近红外荧光量子点为探针则能有效地消除内源性物质荧光的干扰。核酸适体具有选择性高、稳定性好、价格低等优势，已广泛应用于生命科学、环境监测、疾病诊断和食品安全监测分析[16-18]；然而，核酸适体用于检测中药材中痕量OTA的报道较少。本文利用核酸适体高选择性、近红外荧光碳量子点优异的荧光特性，建立了简单、快速、灵敏的中药材中痕量OTA的生物传感检测新方法。

2 实 验

2.1 主要试剂与仪器

巯基修饰的OTA核酸适体核酸(Apt)序列[16,19]:HS-AAAAAAGATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA由生工生物工程(上海)股份有限公司提供；赭曲霉毒素A(OTA)、赭曲霉毒素B(OTB)、黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、伏马毒素B1(FB1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)等真菌毒素均由北京华安麦科生物技术有限公司提供；氯金酸、柠檬酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP) 等购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；考马斯亮蓝、葡萄糖和乙二胺等购自国药试剂有限公司；其他试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。

荧光测定在RF-5301PC荧光分光光度计(日本岛津公司)上进行。

2.2 实验方法

2.2.1 近红外荧光碳量子点的制备

近红外荧光碳量子点(NIRF-CQDs)按文献[20] 方法并进行适当改进合成。简言之，先将3%的葡萄糖水溶液置于200 ℃的水热反应釜的恒温鼓风干燥箱中加热反应4 h，取出自然冷却至室温，过滤、离心除去大颗粒，制得最大荧光发射峰位于440 nm 左右的碳量子点预备溶液。取制备的碳量子点预备溶液2 mL, 加入1%考马斯亮蓝溶液5 mL、1%乙二胺溶液2 mL，超声5 min，加入40 mL 水，转至水热反应釜中，在200 ℃下反应4 h，取出自然冷却至室温，10 000 r·min-1离心10 min，过滤，然后在经透析洗涤后，将透析袋中溶液旋转蒸干，即得到荧光发射为744 nm的近红外碳量子点，置于阴凉处备用。

2.2.2 金纳米粒子的制备

金纳米粒子(AuNPs)按文献[21]方法以柠檬酸钠还原氯金酸制备，即：取250 mL 0.1 mmol·L-1HAuCl4溶液置于洁净的烧杯中，在剧烈搅拌下加热至沸腾，然后迅速加入5 mL 38.8 mmol·L-1柠檬酸钠，溶液颜色由浅黄变为酒红色，继续反应30 min后冷却至室温。AuNPs 的浓度按文献[22]方法测定为2.7 nmol·L-1。

2.2.3 金纳米粒子表面修饰核酸适体

巯基修饰的核酸适体在金纳米粒子进行表面自组装按文献[23]方法进行。取巯基修饰的Apt与TCEP(Apt∶TCEP=1∶5)混匀反应1 h，即得活化的Apt；然后将活化的Apt与2.7 nmol·L-1AuNPs 混合，加入500 mmol·L-1酒石酸-HCl 缓冲溶液(pH=3.0)，在室温下孵化30 min，转至10 000 r·min-1离心25 min 除去未修饰到金纳米粒子表面的Apt，再用pH=7.3的10 mmol·L-1磷酸盐缓冲溶液(PBS)冲洗，如此3次，得到Apt修饰的金纳米粒子(AuNPs/Apt)，将其分散于水中，4 ℃下储存备用。

2.2.4 AuNPs/Apt/NIRF-CQDs复合物的制备

将NIRF-CQDs与AuNPs/Apt在10 mmol·L-1pH=7.3 的PBS溶液中混合均匀，静置反应10 min，离心去除过量的NIRF-CQDs，沉淀再用二次蒸馏水洗涤，再离心，如此3次，得到AuNPs/Apt/NIRF-CQDs复合物，备用。

2.2.5 OTA测定

先将AuNPs/Apt/NIRF-CQDs复合物超声分散至水中，测定其荧光强度；然后，向分散液中加入不同浓度的OTA(0～2.40 ng·mL-1)，混匀反应5 min，测定溶液的荧光强度。按同样的方法，向复合物分散液中加入其他真菌毒素(AFB1、AFB2、DON、FB1、OTB和ZEN)，进行传感器的选择性试验，OTA的浓度为1.0 ng·mL-1，其他真菌毒素的浓度均为10 ng·mmol-1，以615 nm为激发波长，测定荧光发射光谱(最大发射波长为744 nm)强度。光谱测定都在室温下10 mmol·L-1PBS(pH=7.3)中进行。所得数据均为3次测定平均值。

2.2.6 中药材中OTA测定

中药样品经研碎，过三号筛，称取其粉末 5 g，加入70%甲醇溶液 50 mL，超声30 min,以4 000 r·min-1离心5 min,取上层清液10 mL，用水稀释至 20 mL,摇匀,即得试样溶液。

取试样溶液适量置于AuNPs/Apt/NIRF-CQDs分散溶液中，混匀，再加入PBS缓冲溶液，摇匀，孵化5 min，测定溶液的荧光强度，确定中药材中OTA含量。

3 结果与讨论

3.1 碳量子点荧光特性

图1是碳量子点的荧光发射光谱。所制备的碳量子点具有很好的近红外荧光发射特性，激发波长位于615 nm时, 所制备的碳量子点的荧光发射最强，其发射峰位于744 nm。以所合成的近红外荧光碳量子点为探针检测OTA，可以很好地避开内源性物质在可见光区的荧光发射，因此能有效地消除内源性物质的干扰。

图1 碳量子点的荧光光谱。a:激发光谱，b:发射光谱。

Fig.1 Fluorescence spectra of CQDs. a: Excitation spectrum. b: Emission spectra.

3.2 方法原理

金纳米粒子具有强烈的荧光猝灭功能[24]。本工作以金纳米粒子为荧光猝灭剂，以近红外荧光碳量子点为荧光探针，构建OTA传感监测平台。先将巯基-OTA核酸适体与金纳米粒子自组装，形成AuNPs/Apt；再向AuNPs/Apt体系中加入NIRF-CQDs，通过静电作用[25]，NIRF-CQDs与AuNPs/Apt自组装生成AuNPs/Apt/NIRF-CQDs复合物，NIRF-CQDs荧光猝灭。向AuNPs/Apt/NIRF-CQDs复合物分散液体系中加入OTA时，Apt选择性地与OTA反应生成Apt-OTA复合物，同时释放出NIRF-CQDs，体系荧光恢复(如图2所示)。根据OTA的浓度与体系的荧光恢复程度之间的关系，实现样品中OTA的检测。

图2 金纳米粒子/核酸适体/NIRF-CQDs+赭曲霉毒素A体系的荧光光谱

Fig.2 Fluorescence spectra of AuNPs/Aptamer/NIRF-CQDs+OTA

3.3 条件优化

3.3.1 核酸适体用量的影响

研究了AuNPs/Apt复合物中Apt与AuNPs的量比对NIRF-CQDs荧光猝灭和恢复的影响，其猝灭程度如图3所示。图3显示，Apt为AuNPs的50～150倍时，NIRF-CQDs的荧光猝灭随Apt的比例增大而迅速增强；达到175～225倍时，体系荧光强度基本稳定。185倍时，荧光猝灭达到最大值。

图3 核酸适体与金纳米粒子的量比对体系荧光猝灭的影响

Fig.3 Influence of aptamer and AuNPs in mole ratio on fluorescent quenching

向已发生荧光猝灭的体系中加入OTA样品，体系荧光强度恢复情况与荧光猝灭的变化类似，与Apt的量有关。Apt用量较低时，荧光恢复程度随Apt的用量增大而增大；Apt的用量为AuNPs的185倍时，体系荧光恢复程度达到最大，之后，荧光恢复测定Apt随用量增大而降低。故在后续试验中选择Apt的用量为AuNPs的185倍(量的比)。

3.3.2 pH值对体系荧光强度恢复的影响

由于NIRF-CQDs表面氨基对H+离子敏感，在酸性环境中NIRF-CQDs接受质子，使荧光猝灭；同样，在较高pH值(碱性)环境中，其表面氨基可以形成氢键，引起碳量子点的团聚，也使荧光猝灭。因此，研究了弱酸性至弱碱性范围(pH=4.0～9.0)体系荧光强度变化，结果见图4。从图4可知，在pH=4.0～6.5时，体系荧光强度随pH升高而呈线性增大，这是由于随体系pH增大，碳量子点表面接受质子能力减弱所致；在pH=6.5～7.5范围，体系荧光强度变化缓慢，且在pH=7.0～7.5时出现一稳定的最大值平台；之后又呈线性减弱变化，这是碳量子点团聚所导致的荧光猝灭现象。在pH=7.0～7.5范围内，体系荧光变化对pH不敏感，因此， pH控制在该范围内，体系荧光强度有很好的重现性，并不受pH变化的影响，故在后续试验中，控制体系pH=7.3。

图4 pH对体系荧光强度恢复的影响

Fig.4 Influence of pH on fluorescence intensity recovery in the system

3.3.3 孵化时间的影响

研究显示，复合物中Apt能迅速地与OTA结合并释放出NIRF-CQDs。室温环境中，当样品与复合物混合，体系荧光强度迅速恢复，孵化5 min后，体系荧光强度不再增大，并在40 min 保持稳定。后续试验中孵化时间定为5 min。

3.3.4 其他真菌毒素物的影响

图5是OTA核酸适体传感对OTA与其他真菌毒素的选择性试验。结果显示，其他真菌毒素无干扰。因此，OTA核酸适体传感可用于中药材复杂体系中的OTA测定。

图5 核酸适体传感分析的选择性，OTA为1.0 ng·mL-1，其余真菌毒素浓度为10 ng·mL-1。

Fig.5 Selectivity of the aptasensor assay, concentration of OTA: 1.0 ng·mL-1, others: 10.0 ng·mL-1.

3.3.5 标准曲线和检出限

取AuNPs/Apt/NIRF-CQDs分散液0.1 mL用10 mmol·L-1PBS(pH=7.3)稀释至2 mL，测定体系的荧光强度，记为F0；再分别依次向上述方法制备的溶液中加入不同浓度的OTA标准溶液，孵化5 min，测定体系荧光，记为F；其荧光强度差值为体系荧光恢复程度y=F-F0。试验结果如图6所示，体系的荧光强度随着OTA的浓度增大而增强，并且，体系的荧光恢复程度y与OTA浓度在0.015～1.5 ng·mL-1范围内呈现出良好的线性关系，其线性回归方程为y=1.816+123.4C(C为OTA的浓度，单位：ng·mL-1)，相关系数R2=0.998 3，方法检出限(3σ/k)为8 pg·mL-1。

图6 体系的荧光强度随OTA浓度(0,0.015,0.030,0.050,0.10,0.20,0.30,0.50,0.75,1.00,1.50 ng·mL-1)的变化情况。插图：F-F0与OTA的浓度在0.015～1.5 ng·L-1范围内成良好的线性关系。

Fig.6 Dependence of fluorescent intensity on the concentration of OTA(0, 0.015, 0.030, 0.050, 0.10, 0.20, 0.30, 0.50, 0.75, 1.00， 1.50 ng·mL-1). Inset shows the linear relationship between theF-F0and OTA concentration within the range of 0.015-1.50 ng·mL-1.

3.4 分析应用

将所构建的核酸适体传感体系应用于中药材样品中的 OTA 检测，结果如表1所示。

从表1 可知，所测样品均不同程度地受到OTA污染，其中麦芽和甘草污染较为严重，表明麦芽和甘草易受OTA污染，应加强对它们的质量监控。另外，回收率和 RSD 的结果表明，该传感体系适用于中药材中残留真菌毒素检测。

表1 几种中药材样品中 OTA的检测

4 结 论

核酸适体、金纳米粒子和NIRF-CQDs通过自组装形成AuNPs/Apt/NIRF-CQDs核酸适体纳米复合物，使复合物中近红外荧光碳量子点的荧光猝灭，复合物中Apt与OTA特异性结合，释放出NIRF-CQDs，使其荧光恢复，据此，建立了近红外荧光测定OTA的新方法；而以近红外荧光量子点为探针能有效地消除内源性物质的干扰，提高了检测的选择性。对连翘、麦芽、甘草等中药材中的OTA进行测定，显示麦芽、甘草受OTA污染较为严重。该方法在实际样品分析中的回收率在96.8%～104.2%，相对标准差小于5%，能满足中药材中微量OTA的检测要求。