外泌体作为中药新活性成分的研究进展＊

高文静，侯 敏，王 攀，蔺亚东，刘建勋，任钧国＊＊

（1. 中国中医科学院西苑医院基础医学研究所 中药药理北京市重点实验室，北京 100091）

由于外泌体的膜结构以及特殊的胞质成分，使其在动物的生理和病理过程中起着重要的介导作用[1]。研究者们在动物外泌体上不断有新的发现和突破，如来自梗死心肌的外泌体miRNA 能够动员骨髓祖细胞的转运，实现心肌损伤修复[2]；由胃肿瘤细胞释放的外泌体可以通过递送miR-135b 来抑制内皮细胞中的FOXO1表达并促进血管生成等。此外，以动物细胞外泌体为载体，携带植物miRNA 进行疾病治疗的研究也是一大热点，例如将浆果的花青素载入巨噬细胞外泌体，用以治疗卵巢癌[3]，但是单纯利用药用植物外泌体治疗疾病的研究则较少。

植物药是中药的主要组成部分，其所含的黄酮、皂苷、生物碱等次生代谢产物已被系统性研究。但由于中药多成分、多靶点、多途径的作用特点，许多中药的有效成分及作用机制仍未得到有效阐释[4]。随着在人乳中检测到的植物miRNA，并且可能影响着婴儿体中几条重要的生物途径[5]，以及美国加州大学河滨分校金海翎教授课题组发现了宿主拟南芥细胞外泌体可以传递sRNAs 至真菌病原体灰霉病菌并富集，诱导关键致病性真菌基因沉默[6]等，以药用植物外泌体作为中药活性成分进行的研究也在逐渐展开。本文整理了生姜、红景天、蒲公英、金银花等中药外泌体的相关文献，总结了植物外泌体的提取方法，并对中药外泌体的应用进行了探讨。

1 外泌体的形成与特征

1.1 外泌体的形成

外泌体是细胞间通讯的关键信使[7]，是由多囊体与质膜融合，将多泡内含体释放到细胞外环境中形成的。而这些多泡内含体则是外泌体的前体，其包含着RNA(包括mRNA、miRNA 和其他非编码RNA)、DNA 和脂质[8]（图1）。此外，有研究表明，在中药煎煮过程中，外泌体可以维持miRNA 的稳定性[9]，并将miRNA 等物质传送给靶细胞，介导多种生理和病理过程[1,7]。

1.2 外泌体的特征

1.2.1 形态特征

目前对动物的细胞外囊泡进行了分类，按囊泡特定的蛋白质标记和来源多被分为（1）外泌体、（2）微粒/微囊泡、（3）凋亡小体等三类[1]。外泌体的直径大约在40-150 nm[8]之间，药用植物外泌体与动物外泌体形态结构相类似[10]，具有磷脂双分子层结构，是由大多数细胞分泌的纳米级小囊泡，呈茶托状或杯状[11]，其形态可以利用透射电子显微镜进行观察。

1.2.2 生化特征

外泌体内含DNA、特异蛋白质和复杂RNA 等，可以在细胞间转移传递核酸、生物活性脂质和蛋白质等物质[12]。由于细胞来源不同，外泌体所含的成分也不尽相同，但蛋白类多含有膜转运蛋白和融合蛋白（GTPases、annexins 和flotillin），肌动蛋白以及与代谢相关的酶类等[11]；脂质多为鞘磷脂[13]、磷脂酰胆碱[14]、甘油类[15]等；核酸类成分多为miRNA、mRNA、DNA 等。此外，不同来源的细胞根据其特性所含的成分种类及含量都有所变化，例如生姜外泌体中含有较高的6-姜酚等化学成分[15]。

图1 外泌体的形成[16]

2 外泌体的分离与鉴定

2.1 外泌体的分离

外泌体的分离是一般根据其特殊的理化性质[17]，如大小、形状、密度、电荷、溶解度、表面蛋白和膜脂组成等进行分离。现在随着科学技术的快速发展，许多用来分离外泌体的技术也在被不断开发，并且致力于提高外泌体的提取量和纯度。

目前动物外泌体常用的分离纯化方法主要有超速离心法、密度梯度离心法、超滤离心法、多聚物沉淀法、免疫磁珠法以及尺寸排阻色谱法等（图2）。其中超速离心法操作简单，外泌体纯度高，可用于外泌体的蛋白、DNA 和免疫功能研究[18]。密度梯度离心法一般是通过超速离心形成蔗糖浓度梯度条带，而外泌体则多集中1.13-1.20 g·mL-1密度条带。超滤离心是基于粒子大小的外泌体分离技术之一[19]。该法简单高效、快速且不会影响外泌体的生物活性，也不需要特殊设备[20]，是提取细胞外泌体的一种新方法。缺点是外压的使用可能会导致外泌体的变形和破裂，影响分析的结果[21]。多聚物沉淀法优点是能最大程度的保留外泌体生物学活性，适用于外泌体RNA 分析研究，但是耗时长、蛋白杂质多，不适合外泌体蛋白的研究[18]。尺寸排阻色谱法是根据分子大小进行分离，能够较好地保证外泌体的完整性和活性[22]。表1 对上述方法的作用原理及优缺点[23-24]进行了归纳。

图2 外泌体的分离方法

表1 植物外泌体提取分离方法一览表

反观近十年植物外泌体的相关研究，大多使用了超速离心法（差速离心法）[25]联合密度梯度离心法。例如，Li等[26]在提取生姜类外泌体纳米粒子时，将粗滤过的生姜汁在4℃下以10,000 g 离心1 小时，取上清液重复2-3 次，再用100,000 g 离心80 分钟，之后又进行超速离心浓缩并与60%碘乙醇按不同比例混合，最后在4℃下，以40,000 rpm 转速超离心形成了平衡密度梯度，进而收集分析。此外，他们对葡萄柚、胡萝卜、大蒜和姜黄的外泌体也进行了提取，即对净滤好的汁液进行离心（2,000 g 离心20 min；4,000 g 离心30 min；10,000 g 离心1 h），然后将包含着植物纳米粒子的颗粒在4℃，100,000 g下离心1.5 h，最后将分离出的外泌体在蔗糖梯度下进一步纯化[27]。2017 年美国印第安纳大学的Brian D. Rutter[28]将过滤所得的拟南芥质外体液体在10,000 g 下连续离心30 min，40,000 g 下60 min，和100,000 g 下60 min，经过分析处理后，再进行碘氧醇密度梯度离心、纯化。

综上所述，各实验研究的分离方法在时间和离心力的选择上略有差别，但大同小异，多是将榨汁净滤好的液体以小的离心力除去细胞碎片、杂质，再用大的离心力超速离心获取外泌体，在进行实验操作时需根据各自的实验材料和目的进行调节。

2.2 外泌体的鉴定

浏览外泌体的相关研究论文，不论是动物还是植物外泌体，其经典的鉴定方式多采用透射电子显微镜（TEM）[13,29-30]观察其形态。有文献报道，外泌体以钼酸铵染液做负染，其结构边缘染色则更为清楚。在负染后透射电镜下观察，可见十分明显的膜结构，直径在40-150 nm，且呈大小不一的茶托样或杯状（图3）。同时结合纳米追踪分析技术检测外泌体的大小及数量，可以快速、准确的分析外泌体的粒径分布，为外泌体的存在提供有力证据。

图3 外泌体的透射电子显微镜图

3 外泌体作为中药活性成分的应用

植物外泌体含有较为丰富的miRNA，其为一类长度约为22个核苷酸的内源单链非编码RNA，在生物体中起着重要的作用，是一种高效的基因表达调控因子[9]。随着一些常见植物如水稻、葡萄等miRNA 研究的扩大和深入，药用植物miRNA 的研究也迅速展开。且越来越多的报告显示，miRNA 不仅在其原始系统内执行生物学功能，还可以进行跨界基因表达调控[31]。因此，来自药用植物外泌体的miRNA 可能作为新的生物活性成分与哺乳动物系统相互作用。有学者在给小鼠喂食金银花后，在其血清和尿液中可以检测到植物小RNA[32]。北京协和医学院通过给小鼠喂食中药汤剂，对进入人体组织中的中药miRNA 进行了大规模分析，在小鼠肺组织中发现了数以千计的来源于中药的小RNA，经过对来自NCBI GEO 数据库的健康人体组织小RNAseq 原始数据样本以及半枝莲、柴胡、穿心莲、地丁紫堇、黄芩等10 种中药的miRNA 数据库miRBase 进行了筛选鉴定，最终进一步证实了中药miRNA 确实可以跨界转运[33]。此外，我们经常食用的植物性食品，其miRNA 同样能够人体血液中检测到并稳定存在[34]，并起到特定的药理作用。因此，本文就目前主要研究的几种中药外泌体的抗炎、抗病毒、抗纤维化以及抗肿瘤等药理作用进行了归纳总结，见表2。

3.1 抗炎作用

生姜属姜科姜属植物，含挥发油、姜辣素、黄酮类等成分，具有抗炎、抗肿瘤、促消化等作用[35]，其中6-姜辣素具有较强的抗炎作用[36]。随着外泌体的兴起，2018年张皇阁教授团队针对生姜新的活性成分---外泌体进行了研究，并发表了关于生姜外泌体塑造肠道菌群的文章[27]，即通过无菌小鼠和临床试验等，发现生姜外泌体（Ginger ELNs，GELN）中的小RNA 能影响肠道菌群，并完善肠道的屏障功能，其中GELN-RNAs 通过激活AHR 途径诱导IL-22 表达以加强LGG 介导的小鼠结肠炎（DSS）抑制作用。此前，其他研究团队也发现生姜（Ginger-Derived Nanoparticles，GDNPs）可以降低炎性细胞因子（TNF-α、IL-6 和IL-1β），增加结肠炎模型中的抗炎细胞因子（IL-10 和IL-22）的表达[15]；对于一些非药用的植物，如西兰花[37]、葡萄[38]，亦分别从中提取出类似外泌体的纳米粒子（Broccoli-Derived Nanoparticle，BDN；Grape Exosome-like Nanoparticles，GELNs），并发现BDN 可降低DSS 诱导的TNF-α、IL-17A 和IFN-γ的表达，增加IL-10 的表达，而GELNs 不仅可以调节肠组织的再生过程，更可以参与肠组织的重塑，从而预防或缓解结肠炎。以上实验结果揭示了植物外泌体可以被人体摄取，其包含的miRNAs 分子可以与肠道微生物相互作用以维持肠道健康，同时也从侧面证实植物外泌体可以作为一种新的中药活性成分。

表2 药用植物外泌体的药理作用

3.2 抗病毒作用

金银花，主要化学成分包括五大类，即黄酮类、挥发油类、三萜皂类、无机元素以及有机元素，其中三萜皂类化合物具有良好的抗病毒作用[39]。而目前药理作用研究多集中于抗炎作用，如金银花提取物可以通过抑制促炎因子IL-1β和IL-18 的释放进而起到抗炎作用[40]。在传统中医药治疗上则主要采用其清热解毒功效，在治疗病毒性感冒方面具有良好的效果，但是对于金银花在抗病毒的活性成分以及机制研究上还有所空缺。为此，周振等[41]利用金银花水煎液中提取的miRNA 2911分别进行体内和体外的抗病毒实验，并证实了miRNA 2911 不但能够在金银花水煎液中稳定存在，而且直接针对各种IAV，包括H1N1、H5N1 和H7N9。该研究既表明了miRNA2911 是中药抗病毒的有效成分，也直接证明了金银花的抗病毒作用的物质基础之一是其含有的miRNA2911 能够显著抑制病毒的复制。

3.3 抗纤维化作用

红景天，作为常用中药，主要含有生物碱、黄酮类、挥发油等多种化学成分，具有保护心脑血管、抗纤维化、抗炎或抗病毒等功效[42]。纵观近年来红景天药理作用的研究报告发现，红景天苷为主要活性成分之一，可以通过调控PI3K/Akt信号通路起到抗炎作用[43]，其衍生物还具有抗抑郁及改善学习记忆的作用[44]。而红景天外泌体作为新活性成分也引起研究人员关注，近期北京协和医学院蒋澄宇团队从红景天中提取了含HJT-sRNA-m7 的外泌体，通过体内外试验证实其具有良好的抗肺纤维化作用[14]。该研究发现红景天外泌体（汤剂体）在减轻小鼠疾病症状中起着重要作用，并进一步确定药用植物外泌体作为新的活性成分的价值。

3.4 抗肿瘤作用

肿瘤是严重威胁着人类健康重大疾病，中药在治疗肿瘤上起到了重要的作用，弥补了现代医学的不足。miRNA研究的兴起，让人们逐渐意识到miRNA与肿瘤的增殖和凋亡密切相关[45]。随着对外泌体不断地深入研究，越来越多的研究证据表明植物源miRNAs可以跨越物种，在人体中起到某种调节作用。例如在乳腺癌细胞中，合成的miR 159 模拟物可以通过靶向编码Wnt信号转录因子的TCF7而抑制癌细胞增殖，导致MYC 蛋白水平下降，而通过口服miR 159 模拟物能明显抑制小鼠异种移植乳腺肿瘤的生长[31]。这个发现对于利用携带特定miRNA 的中药外泌体预防和治疗肿瘤来说也是一个新的契机。

3.5 其他

除上述药理作用外，药用植物外泌体及其miRNA还具有免疫调节、降脂等作用。如邵红伟教授团队研究发现甘草的miRNA 对人免疫细胞的基因表达具有明显的调节作用，能够显著抑制T 细胞分化相关基因的表达，以及炎症和凋亡相关基因的表达[46]。水稻中富含的miR168a 能与人/小鼠低密度脂蛋白受体适配器蛋白1（LDLRAP 1）mRNA 结合，降低低密度脂蛋白从小鼠血浆中的去除率[34]，此发现也证明了植物源miRNAs 可以调控哺乳动物靶基因的表达。此外，研究人员在人乳中也发现含有植物源miRNAs，并揭示其可能会对婴儿有机体中几条重要的生物途径起到重要作用[5]。

总之，各种研究表明，药用植物外泌体中的miRNA 确实具有跨界调控其他物种基因的能力，同时可以被稳定吸收进入体内而发挥其特异性的药理作用。更重要的是，药用植物miRNA 也为植物药的物质基础研究提供一种新的研究思路和方法。

4 外泌体作为药物载体的应用

核酸治疗被认为是可以靶向调控并有效抑制疾病相关基因表达的治疗方法，但是由于核酸药物在递送方面的问题，其在临床上的应用受到了许多限制。外泌体的出现则可以解决这一问题。研究发现外泌体可以保护miRNA 在超声、高温以及RNase 处理下的完整性[9]，此外，还可以保护其免受强酸的腐蚀，使miRNA 能够在人体血液中稳定存在[34]，并对人类某些特定基因的表达起到调节作用。重要的是由于其具有靶向递送、低免疫且分布广的特征，因此采用外泌体作为药物传递系统的载体，是克服易降解，跨膜能力有限以及可能引起免疫反应等问题的有效方法[47]。

相比较直接采用药用植物外泌体作为载体的研究报道，以动物细胞外泌体为载体，运送药物到指定器官的研究要更为充足。例如肿瘤，其治疗需要具有低免疫原性和毒性的靶向给药载体[48]，以巨噬细胞外泌体装载紫杉治疗肺癌就起到了较好的效果[49]。此外，锦州医学院用巨噬细胞外泌体携带姜黄素来缓解阿尔茨海默症（AD）这一尝试也取得了一定的成功，较好地缓解了AD 鼠的认知和学习能力障碍[29]。尽管如此，对于用药用植物外泌体作为载体的研究也在逐渐显现，例如蒋澄宇教授的研究团队发现红景天汤剂中的小RNA HJT-sRNA-m7 具有强大的抗纤维化作用[14]，随后利用从红景天汤剂中提取的外泌体（汤剂体）给小鼠灌胃，表现出极佳的抗纤维化作用。此外，利用HJT-sRNA-m7 和鞘氨醇人工合成了本草体，通过给肺纤维化模型小鼠灌胃，也显出良好的抗肺纤维化效果[13]。由此可见蒋澄宇教授研究团队的实验结果表明了药用植物外泌体及miRNA 可以通过口服方式，跨物种靶向调控疾病相关基因的表达，该发现也为药物载体的后起之秀---外泌体给予了肯定。

5 展望

目前，外泌体的研究大多集中在动物细胞外泌体，如来源于肿瘤相关巨噬细胞的细胞外泌体，其含有HIF-1α稳定性lncRNA，可以调控乳腺癌的有氧糖酵解[50]；来源于横纹肌肉瘤(RMS)的细胞外泌体，对受体RMS 细胞和成纤维细胞的增殖有积极的作用[51]；各种研究都在致力于寻找更好的治疗策略以解决各种困扰人类已久的肿瘤、癌症等疑难杂症，并且也确实取到了可观的效果。然而，与中药相关的植物外泌体研究甚少，中药传承千年，经久不衰，在一些疑难杂症上也有着独特的效果。目前，一些中药植物外泌体及其小RNA 所起的药理作用机制尚不明确，所以对中药植物外泌体及其小RNA 研究也是极其重要的。从近期的研究来看，中药植物外泌体确实具有一定的治疗作用，其含有的miRNA 可以利用外泌体为载体跨界调控其他物种基因的表达，以达到抗炎、抗病毒、抗纤维化、抗肿瘤等作用，但目前还有一些研究者保持怀疑的态度。究其原因，现今所证明的中药种类还比较少，不具有广泛性，在证实人体内所含有的某些miRNA确实来自食用的植物药，而非其他因素引起某种miRNA的增加的证据仍略有不足，还有待继续研究。

总之，中药植物外泌体及其miRNA 的相关研究为中药活性成分的研究提供了一个新的研究思路[52]，对中药的药效物质基础研究时也将不仅仅局限于次生代谢产物，可以扩展到核酸等大分子代谢物。同时，这对中药的基源鉴定、质量控制、新药开发等来说也是未来发展的一个新的研究方向。同时明确中药植物外泌体的治疗作用，探索针对疾病治疗的关键小RNA，这对中药的未来发展也具有极其重要的价值。