麦粒灸对抑郁大鼠ERK-Nrf2通路海马神经保护作用机制的研究＊

覃美相，粟胜勇，母 叶，蒋香玉，黄小珍，黄 梅，蔡慧倩

（1. 广西中医药大学研究生学院 南宁 530001；2. 广西中医药大学第一附属医院 南宁 530023）

抑郁症是由多种原因引起的，以情绪持续低落、兴趣下降或烦躁不安等心境及情感性障碍为主要症状的一组临床症候群[1]。其发病率高，仅次于心脏病[2-4]。研究发现，抑郁症的发病与海马神经受损密切相关，其最主要致病机制之一是炎症反应与氧化应激[5-7]。丝裂原活化蛋白酶（MAPKs）是介导细胞内反应的重要信号通路，参与生物活动的生理病理过程，细胞外调节蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）属于MAPK 家族中的一员，是重要的信号转导途径之一，其对神经细胞具有生长、分化、增殖及抑制凋亡的调节作用，并在行为和认知方面如学习、记忆等起关键作用[8,9]；核因子E2 相关因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2）是抗氧化系统及免疫炎症反应中最重要的共同转录因子[10,11]，Nrf2信号通路系细胞内氧化应激最重要的防御环节，当细胞发生氧化应激即可激活Nrf2，引发于其调控下抗氧化物及相关酶类的大量表达，从而抵御氧化应激，避免细胞损伤凋亡[12]。

彭希等[13]研究发现，提高大鼠脑内ERK 信号通路关键分子的功能和表达，可以有效地改善大鼠抑郁行为。Senthil 等[14]报道称ERK1/2 磷酸化可以激活Nrf2和转录因子活化蛋白-1，诱导多种下游基因如血红素氧合酶-1 表达，避免神经元凋亡。目前关于ERKNrf2 信号通路对抑郁症的神经保护作用的研究缺乏，故本实验旨在构建抑郁症大鼠模型，通过与空白组、麦粒灸组、氟西汀组对照，观察大鼠Open-Field 行为学、糖水偏爱、体质量改变情况，运用透射电镜观察海马神经元形态结构，WB 检测海马中P-ERK、Nrf2蛋白的变化，探讨基于ERK-Nrf2 信号通路“通督调气法”麦粒灸对抑郁症模型大鼠海马神经元的影响，以揭示麦粒灸治疗抑郁症的可能作用机制，为临床麦粒灸治疗抑郁症提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

SD 大鼠32 只，SPF 级，体重250±20 g，雌雄各半，动物来源：广西壮族自治区食品药品检验所实验动物中心（动物生产许可证号：SCXK 桂2003-0001）。适应性饲养1 周后，按随机数字表将性别、质量分层，随机分为4组：空白组、模型组、麦粒灸组、氟西汀组，每组8只。实验遵照《关于善待动物的指导性意见》，并严格遵守生物安全制度及相关规章。

1.2 造模方法

所有大鼠购买放置实验室动物房后，适应性饲养1 周，使其机体恢复正常代谢水平，称重记录；适应性饲养后对其进行初始Open-Field 行为学测定、糖水偏爱试验及体质量测量，记录留档。

1.2.1 造模方法

参考文献[15]造模方法并做相应改进，采用孤养结合长期不可预见性温和刺激模型（CUMS），予模型组、麦粒灸组、氟西汀组3组大鼠21 d不同的应激，包括冰水游泳（4℃，5 min），24 h 禁水、禁食，1 min 夹尾，摇晃（1 次·s-1，15 min），昼夜颠倒，束缚（5 min·次-1）等刺激，每种刺激各进行3 次，相邻2 d 采用的刺激方式不同。空白对照组：自由摄食饲养，不接受任何刺激。

1.2.2 模型评价

参照文献[16]对抑郁症模型的评价：大鼠接受21 d慢性综合应激后进行Open-Field 行为学测定、糖水消耗量实验及体质量测量，各项分值均下降，并表现出精神运动迟钝、兴趣下降或丧失、快感缺乏等特征时，提示造模成功。

1.3 干预方法及疗程

1.3.1 空白组

在相同环境下正常饲养，不予任何处理。

1.3.2 模型组

共接受21 天CUMS 造模后继续孤养，不给予任何治疗。

1.3.3 麦粒灸组

参照大鼠穴位图谱[17]选取百会、大椎、至阳、合谷（双）、太冲（双）穴，每日上午9：00 进行麦粒灸治疗。治疗操作：用电动刀片将穴区皮肤刮净，穴区皮肤涂少许石蜡油，将直径约0.2 cm，高约0.2 cm 的圆锥形艾炷置于大鼠穴位皮肤上点燃施灸，灸至以大鼠出现挣扎、撕叫、逃避等行为时用镊子将艾炷取下，此为1壮，每穴每日6壮，连续治疗10 d。

1.3.4 氟西汀组

每日上午9：00 给予氟西汀药物治疗。操作：按1.8 mg·kg-1剂量用生理盐水调配氟西汀，使用灌胃针灌胃给药，每日1次，连续干预治疗10 d。

1.4 主要试剂及仪器

1.4.1 实验主要试剂

Anti-Phospho-ERK1 (T202) + ERK2 (T185)Antibody（厂家：博士德生物，货号：BM5446）；Anti-Nrf2(NFE2L2) Antibody（厂家：博士德生物，货号：PB9290）；山羊抗兔的二抗（厂家：北京博奥森，货号：ZB2301）等。

1.4.2 实验主要仪器

电泳仪（厂家：北京六一，仪器型号：DYCZ-24DN）；半干转膜仪（厂家：日本ATTO，型号：WSE-4040））；称量天平：（厂家：Sartorius 公司，型号：BP310P）；低温离心机：（厂 家：eppendorf，型号：Centrifuge 5417R）UVP凝胶成像系统：（厂家：thermo公司，型号：CA91786 U.S.A UVP GDS-8000 System）等。

1.5 疗效性指标评价

1.5.1 阶段评分变化

造模前、造模后、接受10 d 干预治疗后分别进行3次Open-Field 行为学测定、糖水消耗量实验及体质量测量，对比3个阶段的评分变化。

①敞箱测试得分反映大鼠活动度及对周围事物的兴趣高低。Open-Field 行为评分实验记分方法：以大鼠穿越底面格数为水平活动得分，大鼠四只脚均在同一格子内为一格，穿越1 格记1 分，如大鼠沿线直走，以每10 cm 为1 分；以大鼠直立次数为垂直活动得分，双足离开底面为标志（两前爪腾空或攀附墙壁1次记1分）。两项之和为敞箱实验总得分。

②糖水消耗试验反映大鼠对奖赏的快感反应。糖水消耗量实验：大鼠进行1%蔗糖水摄取实验，第一个24 h，每笼同时放置2个均装有1%蔗糖水水瓶；随后的24 h，放置装有同等容量1%蔗糖水、纯净水各1 瓶，记录各个消耗量；1%蔗糖水消耗量：禁食禁水24 h后，测定1 h大鼠饮用1%蔗糖水和纯净水的量，以计算糖水偏爱度（糖水偏爱=糖水消耗量/总液体消耗×100%）。

③体质量测量结果反映其体重增长趋势。体重测量：分别用电子秤测量各大鼠体重，记录比较各组大鼠体重增减趋势。

1.5.2 主要检测方法

通过透射电镜观察海马神经元形态结构；WB 检测海马组织中p-ERK、Nrf2 的蛋白水平，以观察ERKNrf2信号通路的活化情况。

1.6 标本采集及检测方法

1.6.1 标本采集

各组大鼠共32 只，干预结束后禁食12 h，以脱臼法处死后。分组快速取出大鼠脑组织，并迅速分离出海马组织。取部分海马组织，放入2%戊二醛中固定，作为电镜标本，放入4℃冰箱保存备用。另一部分大鼠海马组织，用生理盐水冲洗分装后迅速置入液氮中保存，而后将标本置于-80℃冰箱保存，待提取其蛋白，用于WB检测。

1.6.2 透射电子显微镜检测

电镜标本制作：①固定：用PBS 漂洗4 次，停留15 min，再用1%锇酸固定1 h。②脱水：梯度丙酮脱水。③渗透：100%丙酮：环氧树脂（1:1）渗透放入恒温箱（60℃）聚合12 h；③切片：半薄切片，染色，在光镜下观察，选定区域，修块，进行超薄切片。染色：20K醋酸铀染色15 min，柠檬酸铅染色5 min，晾干；④透射电镜观测及拍照，观察大鼠海马神经元细胞的结构变化。

1.6.3 蛋白免疫印迹（Western Blot）检测

p-ERK、Nrf2 的蛋白水平检测：①组织研磨及蛋白提取：取30-100 mg组织用液氮进行研磨，加入裂解液，冰上裂解1 h，4℃，13000 r·min-1，离心10 min，将上清转移到新的离心管中。②蛋白浓度测定及样本制备：用考马斯亮蓝试剂盒测定样本蛋白浓度，并记录；将样品加入相应4*loading buffer，100℃煮沸10 min，12000 rpm 离心1 min，准备上样。③SDS-PAGE 电泳：按照目的蛋白分子量大小调配不同浓度的SDS-PAGE胶，其操作步骤如下：制作10%SDS-PAGE凝胶电泳分离胶10 mL；制作5%SDS-PAGE凝胶电泳成层胶5 mL；上样：等胶凝固好后，拔去梳子，电泳缓冲液清洗上样孔，将准备好的样品上样。电泳：起初，恒压80 V，30 min之后恒压调至120 V，持续1 h。④免疫印迹：电泳操作结束后，从玻板上卸下PAGE 胶，装配转膜三明治，恒流，300 mA转60 min，将蛋白转移到PVDF膜上。⑤免疫发光：封闭：用含5%脱脂奶粉的PBST 溶液室温封闭膜2 h；孵育一抗：一抗孵育过夜；洗膜：用TBST洗膜3 次：每次5 min；孵育二抗：用封闭液稀释各蛋白一抗对应的二抗。室温下孵育膜1 h。洗膜：用TBST 洗膜3 次：每次5 min；X 光显影：在暗室中将膜置于平铺好的保鲜膜上，按照同等比例混合A液和B液，将混合液均匀滴加于膜上，等待反应60 s。吸水纸上沥干膜上多余的ECL 底物反应液，置于平板上，铺上保鲜膜，用保鲜膜包裹PVDF 膜，此时注意避免产生气泡，放入暗盒中，而后放上适当大小的X 光片，关闭暗盒，曝光。取出X 光片，放入显影液中，待条带显好后取出，在清水中漂洗一下，放入定影液中定影。取出X 光片，晾干，拍照。

1.7 统计学处理采用

采用SPSS17.0 统计软件进行统计学处理，计量资料用均数±标准差（± S）表示，组间均数的两两比较采用t检验；多个样本间的比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义的标准。

2 结果

2.1 麦粒灸对抑郁症模型Open-Field 行为学（敞箱试验）影响

表1 结果显示，造模前，空白组、模型组、麦粒灸组、氟西汀组各大鼠的敞箱试验总得分差异无显著性意义（P＞0.05）；造模后，与空白组比较，模型组、麦粒灸组及氟西汀组各大鼠的敞箱试验总得分均明显下降（P＜0.05）；治疗后，麦粒灸组、氟西汀组各大鼠的敞箱试验总得分对比模型组均明显升高（P＜0.05）；麦粒灸组与氟西汀组比较无显著性差异（P＞0.05）。

表1 各组大鼠敞箱试验总得分的比较（± s，n = 8）

表1 各组大鼠敞箱试验总得分的比较（± s，n = 8）

注：Δ表示与造模前比较，P ＜0.05；#表示与空白组比较，P ＜0.05;*表示与模型组比较，P ＜0.05；a表示与氟西汀组比较，P ＞0.05.

干预后/分60.00±2.67 25.75±3.77#50.00±5.15*a 54.88±3.68*分组空白组模型组麦粒灸组氟西汀组造模前/分63.50±3.34 60.38±1.41 61.50±2.83 61.50±3.34造模后/分50.13±5.49 44.88±3.29Δ 42.75±2.96Δ 38.25±3.73Δ

2.2 麦粒灸对抑郁症模型大鼠糖水偏爱度的影响

表2 结果显示，造模前，空白组、模型组、麦粒灸组、氟西汀组各大鼠的糖水偏爱度差异无显著性意义（P＞0.05）；造模后，与空白组比较，模型组、麦粒灸组及氟西汀组各大鼠的糖水偏爱度明显下降（P＜0.05）。治疗后，麦粒灸组、氟西汀组各大鼠的糖水偏爱度对比模型组均明显升高（P＜0.05）；麦粒灸组与氟西汀比较无显著性差异（P＞0.05）。

表2 各组大鼠糖水偏爱度的比较（± s，n = 8）

表2 各组大鼠糖水偏爱度的比较（± s，n = 8）

注：Δ表示与造模前比较，P ＜0.05；#表示与空白组比较，P ＜0.05;*表示与模型组比较，P ＜0.05；a表示与氟西汀组比较，P ＞0.05.

干预后/%76.77±2.10 41.20±8.00#67.39±5.85*a 69.67±3.79*分组空白组模型组麦粒灸组氟西汀组造模前/%68.16±4.10 69.45±2.09 66.44±3.33 68.73±2.62造模后/%71.61±4.43 55.50±4.40Δ 51.78±7.00Δ 55.15±5.75Δ

2.3 麦粒灸对抑郁模型大鼠体质重的影响

表3 结果显示，造模前，空白组、模型组、麦粒灸组、氟西汀组各大鼠的体质重差异无显著性意义（P＞0.05）；造模后，空白组大鼠体质重显著高于其他三组(P＜0.05)。治疗后，与模型组比较，麦粒灸组、氟西汀组大鼠体质重均明显升高（P＜0.05）；麦粒灸组与氟西汀比较无显著性差异（P＞0.05）。

表3 各组大鼠体质量测量的比较（± s，n = 8）

表3 各组大鼠体质量测量的比较（± s，n = 8）

注：b表示造模后与模型组、麦粒灸组、氟西汀组比较，P ＜0.05;#表示与空白组比较，P＜0.05；*表示与模型组比较，P ＜0.05；a表示与氟西汀组比较，P ＞0.05.

干预后/g 359.88±27.71 279.13±24.67#347.25±35.07*a 320.00±30.15*分组空白组模型组麦粒灸组氟西汀组造模前/g 234.00±18.97 244.50±2.39 245.13±22.20 246.25±27.21造模后/g 339.25±18.82b 292.25±31.98 299.50±28.06 301.25±34.03

2.4 干预后抑郁模型大鼠海马神经元细胞的结构变化

透射电镜观察发现（图1），空白组:海马组织神经元细胞核结构正常，神经细胞核呈椭圆形，核膜清晰完整，核仁位于核中间，胞浆内细胞器丰富，未见线粒体肿胀坏死。模型组：海马组织神经元细胞核异常，可见神经元细胞肿胀，核内核仁完全溶解消失，可见细胞胞浆疏松，胞浆内细胞器数量明显减少。麦粒灸组：海马组织神经元细胞核轻度异常，神经细胞核呈椭圆形，核膜不清晰，染色质散在分布于核膜上，胞浆内细胞器丰富，未见线粒体肿胀坏死。氟西汀组：海马组织神经元细胞核轻度异常，神经细胞核呈椭圆形，核膜不清晰，可见核仁完全溶解，胞浆内细胞器丰富，未见线粒体肿胀坏死。

图1 各组海马神经元结构变化

2.5 干预后抑郁模型大鼠P-ERK、Nrf2蛋白表达情况

与空白组比较，模型组P-ERK、Nrf2 蛋白表达明显下降（P＜0.05）；与模型组比较，麦粒灸组、氟西汀组p-ERK、Nrf2蛋白表达均明显升高（P＜0.05）；麦粒灸组与氟西汀组比较P-ERK、Nrf2 蛋白表达无明显差异（P＞0.05）（图2，表4，）。

图2

表4 各组大鼠P-ERK蛋白含量的比较（± s，n = 8）

表4 各组大鼠P-ERK蛋白含量的比较（± s，n = 8）

注：Δ与空白组比较，P ＜0.05；*与模型组比较，P ＜0.05；#与氟西汀组比较，P ＞0.05.

分组空白组模型组麦粒灸组氟西汀组例数/n 8 8 8 8 P-ERK 1.875±0.339 0.668±0.265Δ 1.460±0.221*#1.218±0.180*Nrf2 2.505±0.153 0.395±0.117Δ 1.157±0.274*#0.914±0.741*

3 讨论

抑郁症归属于中医“郁证”、“百合病”等范畴，祖国医学认为忧思等情志过极为本病的主要原因，情志抑郁使气机不畅，气机疏泄失常，阳气舒发不利，清阳不展系发为本病的关键。百会乃足太阳、手足少阳、督脉、足厥阴肝经之交会穴，属督脉，乃经脉交会之最，刺激此穴，具有温经，升阳固脱，安神健脑，清热开窍等作用；《素问·骨空论篇》曰：“督脉者，起于少腹以下骨中央……上额交颠上，入络脑。”灸取百会可通调督脉，调动机体阳气生发，疏通肝经之气；《甲乙经》述“大椎……三阳督脉之会。”灸取大椎能温阳推动阳气生化运转；至阳，至，有至极之意，穴属督脉，位于背部，当第七椎之下，督脉为阳经，背亦属阳，七乃阳数，三阳为极，结合艾灸温通之性，可升提一身之阳气；太冲为足厥阴肝经原穴，属阴主血，主“胸胁支满, ……终日不得太息”，合谷乃手阳明大肠经之原穴，属阳主气，两穴相配，可气血、脏腑同调；诸穴合用意有“通督调气”之旨，治可疏肝理气，调养心神，协调脏腑，鼓动气机，宣发阳气，调节情志。

慢性应激能够激活免疫系统，刺激产生炎性细胞因子，系诱发抑郁症发生的重要因素[18]。而心理应激是抑郁症发生或复发的另一危险诱因，其可激活交感神经系统释放儿茶酚胺，进而使大脑耗氧量增加；激活HPA 轴大量释放的糖皮质激素激活免疫应答与炎性反应系统，导致炎性细胞因子增多，且细胞因子与炎症细胞相互作用可引起自由基的产生增加[19-20]。MAPK 通路是生物体内重要的信号转导系统之一，参与细胞生长、发育、分化、凋亡及细胞间的功能同步等多种生理反应。而ERK 属于MAPK 的一员，其可通过直接或间接活化作用，抑制细胞凋亡，促进细胞存活[21]。MAPK 激活可促进ERK 发生磷酸化从而激活下游转录因子，Nrf2 转录因子是细胞抗氧化还原的核心环节，在氧化应激反应中起关键作用，可驱动自由基阳离子通道发挥内源性稳态，在抑制炎症、避免细胞凋亡、保护神经等方面起着重要的作用[22,23],而提高ERK1/2活性可有效减少神经细胞凋亡[24]。

研究发现[25]，ERK 信号通路能被抗抑郁药及情绪稳定剂激活，对大脑中神经产生、突触可塑性起调节作用，也有报道指出，氟西汀治疗能促进大鼠内侧前额叶皮质边缘下区ERK1/2 的活化，对恐惧记忆具有促消退的作用[26]。既往研究发现，氟西汀干预治疗，能减少肺炎球菌性脑膜炎大鼠海马凋亡比例，相关实验表明，氟西汀可抑制抑郁大鼠海马凋亡信号，上调细胞存活信号通路mTOR及下游靶分子磷酸化水平及突触重塑相关蛋白的表达，下调自噬蛋白对突触重塑的降解作用，从而起到抗抑郁作用[27,28]。表明氟西汀对不同的神经系统疾病具有不同的调控作用，本研究结果显示：氟西汀干预治疗后，大鼠的活动度、对周围事物的兴趣、对奖赏的快感升高等，均表明其抑郁症状改善，这可能与ERK磷酸化水平P-ERK蛋白表达升高，激活下游转录因子，上调Nrf2蛋白表达，改善海马神经元细胞结构，从而起到抗抑郁作用的协同效应有关。

研究表明，灸法治疗抑郁症可提高患者的生活质量[29-31]。相关动物实验研究发现，灸法可通过增加脑源性神经营养因子，从而改善抑郁症大鼠的记忆力[32]。亦有报道指出，ERK1/2 磷酸化可以激活Nrf2，诱导多种下游基因表达，从而避免神经元凋亡[33]。本实验研究结果显示：治疗后，与空白组比较，模型组行为学评分、糖水偏爱度、体质量显著下降（P＜0.05），海马神经元细胞结构不完整、胞浆内细胞器数量减少（P＜0.05），p-ERK、Nrf2 蛋白表达降低（P＜0.05）；与模型组比较，麦粒灸组及氟西汀组行为学评分、糖水偏爱度、体质量显著上升（P＜0.05），海马神经元细胞结构改善、胞浆内细胞器数量增多（P＜0.05），p-ERK、Nrf2蛋白表达显著升高（P＜0.05）；与氟西汀组比较，麦粒灸组行为学评分、糖水偏爱度、体质量、海马神经元细胞结构及胞浆内细胞器数量无显著差异（P ＞0.05）。表明麦粒灸可有效改善抑郁症大鼠的抑郁症状，其作用机制可能与通过上调海马组织ERK 的磷酸化水平P-ERK，促进诱导Nrf2 蛋白表达上升，抑制炎症反应及氧化应激，减少细胞凋亡，修复神经损伤来发挥抗抑郁作用有关。

综上分析，“通督调气法”麦粒灸治疗具有明显的抗抑郁作用，其作用机制可能与通过上调大鼠海马组织ERK 的磷酸化水平P-ERK，促进诱导Nrf2 蛋白表达上升，激活神经元的生物学效应，抑制炎症反应及氧化应激而发挥抗抑郁作用有关。而对比氟西汀治疗，麦粒灸治疗具有安全、经济、无毒副作用等优点，值得临床推广运用。