Cu2+胁迫对亮斑扁角水虻幼虫血淋巴能量物质水平的影响

孙虹霞,吴启仙,廖 业,高嘉敏,柳 琳,夏 嫱

(遵义医学院珠海校区 免疫学与病原生物学教研室,广东 珠海 519041)

亮斑扁角水虻(HermetiaillucensL.)俗称黑水虻，是双翅目水虻科重要的资源昆虫，其幼虫可以有效消耗和降解多种有机物质，如畜禽粪便、腐烂有机物等[1]，被世界各国广泛用于动物粪便无公害化处理。其处理后副产品含有较高水平的粗蛋白、粗脂肪[2]、月桂酸[3]、肉豆蔻酸及人体和禽畜体内所需的多种氨基酸，在饲料及医药研发中亦具有无限的潜能[4]。

Cu作为一种有效的促生长剂广泛添加于禽畜饲料中，但禽畜对饲料中Cu2+的利用率较低，90%以上通过粪便排出体外，造成粪便中Cu2+的大量累积。研究表明，北京规模化养殖场猪粪中Cu2+最高含量可达1 170.00 mg/kg[5]，河北、四川等地禽畜粪便中Cu2+含量亦超标严重，猪粪中Cu超标率达到80%以上[6-7]。课题组前期研究表明，Cu2+可在亮斑扁角水虻幼虫表皮、血淋巴、脂肪体及中肠中累积，并对其生长发育产生影响[8]。

血淋巴是昆虫能量物质和代谢的主要场所。在血淋巴中，糖、脂和氨基酸等能量物质依照特定的代谢途径提供生长发育所需的营养物质，随后被中肠吸收并存储在脂肪体内供虫体生命活动所需。然而，重金属的积累可通过影响昆虫食物利用率和转化率等影响血淋巴中的能量物质代谢，并对其生长发育产生促进或阻抑作用[9]，影响程度与重金属的种类、昆虫种类和发育阶段都存在着一定的关联[10]。前期研究表明，累积在亮斑扁角水虻幼虫体内的Cu2+对亮斑扁角水虻的生长发育产生了影响，并存在低剂量促进而高剂量抑制的现象[8]；我们推测其对幼虫血淋巴的能量代谢也产生了影响，但影响的程度如何？在不同发育阶段有何异同？是否与饲料中的Cu2+剂量存在相关性？对这些问题的回答，可对我们了解重金属对亮斑扁角水虻能量物质代谢的影响，以及其作为蛋白质和脂类替代物潜能的影响提供一定的理论支持。

鉴于此，本研究将不同浓度Cu2+添加至人工饲料中，连续5代胁迫亮斑扁角水虻幼虫。随后，检测Cu2+在不同胁迫世代亮斑扁角水虻6龄幼虫体内的积累，并探讨Cu2+对不同发育阶段亮斑扁角水虻幼虫血淋巴中能量物质总糖、蛋白质和脂类水平的影响，以期阐述Cu2+胁迫对亮斑扁角水虻幼虫能量物质代谢的影响程度。

1 材料与方法

1.1 实验昆虫及Cu2+胁迫处理 亮斑扁角水虻：珠海市现代农业发展中心提供；饲养条件：温度为(27±3)℃，光照周期为14 L：10D，湿度为(80 ± 8)%。将不同剂量的CuSO4·5H2O添加至亮斑扁角水虻人工饲料中，使饲料中的Cu2+终浓度分别为75、150、300、600、1200 mg/kg(质量比)，以不添加Cu2+饲料饲养亮斑扁角水虻幼虫为对照(记为0 mg/kg)。以第1代幼虫化蛹后，羽化成虫所产卵作为第2代虫源，第3代以此类推。每天更换饲料并连续胁迫5个世代。每个重金属浓度处理设3个重复，每个重复60头幼虫。

1.2 主要试剂及仪器 CuSO4·5H2O购自广州试剂一厂、N-Phenylthiourea购自Alfa Aesar公司、磺基水杨酸购自天津市大茂化学试剂厂、蒽酮购自上海市国药集团化学试剂有限公司、香兰素购自上海市国药集团化学试剂有限公司，以上试剂均为分析纯；考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒购自南京建成科技有限公司。等离子体原子发射光谱仪ICP-AES，Thermo Jarrell Ash Corporation生产；紫外可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司，型号：UV752；台式高速冷冻离心机，Thermo公司，型号：Multifuge X1R。

1.3 幼虫血淋巴中Cu2+浓度的测定 选取长势均一的不同浓度Cu2+处理的6龄幼虫各30头，清洁虫体后，断头法取血淋巴，烘干后置于称量瓶中，依照夏嫱等(2008)[11]的方法对对照和各处理虫体的血淋巴进行消化，并按照下列公式计算血淋巴中的Cu2+浓度：Cu2+浓度=C×50/W(mg/kg)，其中C为ICP-AES检测结果，W为样品干重。

1.4 幼虫血淋巴能量物质测定 分别选取75、150、300、600、1 200 mg/kgCu2+胁迫下长势均一的第1、3、5代5龄始至6龄末亮斑扁角水虻幼虫，分别记为0、24、48、72、96、120 h幼虫，每个时间段幼虫均为20只，清洁消毒后断头取血淋巴，加入含有N-Phenylthiourea的Eppendorf管中，混匀，4 ℃ 15 000 rpm离心5 min，取上清，每个处理3个重复。蒽酮比色法测定幼虫血淋巴中总糖含量，以0.01%葡萄糖制作标准曲线；考马斯亮蓝法测定幼虫血淋巴中蛋白质含量，蛋白浓度(g/L)= (测定管A值-空白管A值) /(标准管A值-空白管A值)× 标准管浓度(0.563 g/L)× 稀释倍数(200倍)；磷酸香草醛显色法测定幼虫血淋巴中脂肪含量，以胆固醇(含2.5 mg/mL甲醇)制作标准曲线。

1.5 统计学方法 采用SPSS 19.0统计分析软件，计量资料两组间采用配对t检验；多组间采用单因素方差分析，P<0.05具有统计学差异。

2 结果

2.1 Cu2+在亮斑扁角水虻幼虫血淋巴内的积累 随着饲料中Cu2+浓度的增加，同一世代亮斑扁角水虻幼虫血淋巴中Cu2+含量呈递增的趋势，且各世代中受600和1 200 mg/kg处理虫体血淋巴中积累的Cu2+浓度显著高于对照和其它处理中的浓度。与对照相比，75和150 mg/kg Cu2+的胁迫也显著增加了第5代幼虫血淋巴中的Cu2+浓度。

随着胁迫世代数的增加，同一浓度胁迫下的亮斑扁角水虻幼虫血淋巴中Cu2+含量也呈递增的趋势。然而，只有受1 200 mg/kg Cu2+胁迫幼虫血淋巴中的Cu2+浓度在第1、3和5世代中存在显著差异(见表1)。

Cu2+浓度(mg/kg)亮斑扁角水虻幼虫血淋巴中Cu2+浓度(mg/L)第1代第3代第5代02.31±0.44c2.57±0.91def2.94±0.88d753.24±0.14c3.45±0.20de4.42±0.11cd1503.64±0.98bc4.00±0.21cd4.60±0.33c3004.78±0.09b5.03±0.16c5.53±0.20c6005.83±0.32b6.60±0.28b7.13±0.31b1 2008.68±0.40a11.40±0.30a#17.56±0.95a#

表中同一列平均数后不同小写字母表示同一世代不同浓度重金属处理间差异具有统计学意义(P<0.05)；#:表示同一重金属处理浓度下的第3、5代含量与第1代相比具有统计学意义(P<0.05)。

2.2 Cu2+胁迫对亮斑扁角水虻幼虫血淋巴总糖含量的影响 不同浓度Cu2+胁迫对第1、3、5代亮斑扁角水虻幼虫(0～120 h)血淋巴中总糖含量的影响及方差分析(见图1)。

在各个发育节点，第1、3和5代幼虫血淋巴中的总糖含量均低于对照虫体中的含量(除第3代24 h和120 h取样点)，并随饲料中Cu2+浓度的增加而减少。在受Cu2+胁迫的第1代幼虫血淋巴中，0～24 h和96～120 h时间点的总糖含量只在受1 200 mg/kg Cu2+处理中显著降低，而48～72 h时间点的总糖含量在各处理中均显著下降(P<0.05)。胁迫至第3代，各时间点受600～1 200 mg/kg Cu2+处理幼虫血淋巴中的总糖含量在均显著低于对照，但第24 h时间段幼虫血淋巴中的总糖含量在75～150 mg/kg处理浓度下显著高于对照组(P<0.05)。对第5代数据的分析表明，150～1 200 mg/kg Cu2+胁迫均显著降低了第5代亮斑扁角水虻幼虫(0～120 h)血淋巴中总糖含量(P<0.05)。

随着胁迫世代数的增加，亮斑扁角水虻幼虫血淋巴中的总糖含量呈下降的趋势。就同一处理浓度下的总糖含量而言，0 h取样点的含量在各世代间不存在显著差异；24 h和120 h取样点的含量在第1、5世代间没有显著差异，但均低于第5代中的含量；在第48～96 h取样点，第1、3代不存在显著差异，但显著低于第5代中的含量(P<0.05)。

A:0 h; B:24 h; C:48 h; D:72 h; E:96 h; F:120 h。每取样点柱形图中，不同的小写字母表示同一世代虫体血淋巴中的总糖含量在不同重金属处理间存在显著差异(P<0.05)；不同大写字母表示同一重金属处理下血淋巴中的总糖含量在不同世代间存在显著差异(P<0.05)。图1 第1、3、5代亮斑扁角水虻幼虫不同浓度Cu2+胁迫后0～120 h血淋巴的总糖含量

2.3 Cu2+胁迫对亮斑扁角水虻幼虫血淋巴蛋白质含量的影响 在各处理浓度Cu2+胁迫下，第1代幼虫(0～120 h)血淋巴中的蛋白质含量与对照组相比均显著增加(P<0.05)，而第3、5代各时间点幼虫血淋巴中的蛋白质含量均显著低于对照。此外，各处理幼虫血淋巴中的蛋白质含量随Cu2+浓度的增加呈下降的趋势。同时，在同一浓度的Cu2+胁迫下，各时间点的第1、3、5代幼虫血淋巴中的蛋白质含量在各世代间均存在显著差异(P<0.05，见图2)。

A:0 h; B:24 h; C:48 h; D:72 h; E:96 h; F:120 h。每取样点柱形图中，不同的小写字母表示同一世代虫体血淋巴中的蛋白质含量在不同重金属处理间存在显著差异(P<0.05)；不同大写字母表示同一重金属处理下血淋巴中的蛋白质含量在不同世代间存在显著差异(P<0.05)。图2 第1、3、5代亮斑扁角水虻幼虫不同浓度Cu2+胁迫后0～120 h血淋巴的蛋白质含量

2.4 Cu2+胁迫对亮斑扁角水虻幼虫血淋巴脂肪含量的影响 不同浓度Cu2+胁迫对第1、3、5代亮斑扁角水虻幼虫血淋巴中脂肪含量的影响及方差分析如图3所示。

结果表明，除第1代0 h时间段的幼虫外(但各处理浓度间及与对照间差异均不显著)，各时间点第1、3、5世代幼虫血淋巴中的脂肪含量均随饲料中Cu2+浓度的增加而减少，且150～1 200 mg/kg处理浓度Cu2+胁迫均显著降低了第1、3、5代亮斑扁角水虻幼虫(0～120 h)血淋巴中脂肪含量。

随着胁迫世代数的增加，第3、5代亮斑扁角水虻幼虫血淋巴中的脂肪含量在300～1 200 mg/kg Cu2+胁迫下(除去72 h、96 h)显著低于第1代(P<0.05)。

A:0 h; B:24 h; C:48 h; D:72 h; E:96 h; F:120 h。每取样点柱形图中，不同的小写字母表示同一世代虫体血淋巴中的脂肪含量在不同重金属处理间存在显著差异(P<0.05)；不同大写字母表示同一重金属处理下血淋巴中的脂肪含量在不同世代间存在显著差异(P<0.05)。图3 第1、3、5代亮斑扁角水虻幼虫不同浓度Cu2+胁迫后0～120 h血淋巴的脂肪含量

3 讨论

重金属能在生物体内积累并干扰生物的正常新陈代谢，其中，能量物质代谢的变化是机体对重金属胁迫的反应之一。在本研究中，我们发现重金属Cu2+可在亮斑扁角水虻血淋巴中积累，并随胁迫浓度的增加而增加。其中，第1、3和5代的总糖含量(除第2代24 h和120 h取样点)和脂肪含量均随Cu2+浓度的增加而递减；除第1代外，蛋白质含量也随Cu2+浓度的增加而呈递减的趋势。同时，随着胁迫世代数的增加，各处理浓度下的能量物质的含量与对照的差异也趋于显著。

前期研究证实，Cu2+可在亮斑扁角水虻幼虫体内积累，并可存储在表皮、中肠和脂肪体等组织内。各组织中的重金属含量随饲料中Cu2+浓度的增加而增加，并表现为中肠>脂肪体>表皮的规律[12]。通常，过量的重金属可通过中肠上皮细胞基底膜进入血淋巴，并通过血淋巴转运至脂肪体和表皮等组织。因此，我们在亮斑扁角水虻的血淋巴中也检测到了Cu2+的存在，并存在与其它组织类似的积累规律。

研究表明，昆虫体内能量物质如碳水化合物、蛋白质和脂质等会因重金属的胁迫而发生变化[13-14]，并与昆虫的种类、重金属的种类及浓度相关[15]。在本研究中，亮斑扁角水虻幼虫血淋巴中的能量物质也对Cu2+的胁迫产生了应激反应。亮斑扁角水虻在受Cu2+胁迫的第1代幼虫血淋巴中，各时间段的总糖和脂肪含量均随胁迫浓度的增加而下降，但蛋白质含量均高于对照组的含量。总糖和脂肪含量的下降是生物体对毒性作用的反应机制之一，这与双翅目昆虫摇蚊和棕尾别麻蝇对Cd2+胁迫的反应类似[16-17]；同时，脂肪含量的减少可能也意味着其代谢物可为蛋白质的合成提供底物分子。因此，在Cu2+胁迫相对较短(1个世代)的时间内，亮斑扁角水虻幼虫迅速调整了糖、蛋白质和脂类的代谢过程，以防御Cu2+对机体的胁迫作用。

和对照相比，第3、5代幼虫血淋巴中的总糖、蛋白质和脂肪含量均呈下降的趋势。例外的是，第3代24 h和120 h时间点的受Cu2+胁迫幼虫血淋巴中的总糖含量高于对照虫体中的含量。这两个时间节点分别对应5龄期和6龄期幼虫的初始发育阶段，总糖含量的增高，可能是幼虫为保持糖原稳点性的应激反应。此外，Cu2+可刺激水生生物CyprinuscarpioL.血淋巴中蛋白质的代谢，其分解产生的氨基酸可作为糖类或其它物质合成的底物[18]。但本研究中糖和蛋白质代谢的关联还有待于进一步的研究。再者，在Cu2+的持续胁迫下，血淋巴中渐增的Cu2+浓度最终损害了幼虫的能量代谢过程，显著降低了第5代血淋巴中的能量物质的含量，这可能也意味着幼虫在对Cu2+的解毒过程中消耗了相对较多的能量。这些结果与家蝇幼虫血淋巴能量物质储备随着Cd剂量增加而下降的报道相一致[19]；与此类似，甲壳类动物在受到重金属胁迫后血淋巴的热量值也呈下降的趋势[20]。然而，低浓度Zn2+处理增加而高浓度Zn2+胁迫降低了亮斑扁角水虻血淋巴中的能量物质[21]；受Ni2+长期胁迫的斜纹夜蛾幼虫可通过提高蛋白质含量，降低总糖和脂肪含量以满足能量的需求[10]。这些研究也表明，重金属对昆虫能量物质含量的影响与重金属的种类和昆虫种类等都存在一定的关联。

相关的研究证实，海藻糖和糖原是最易受重金属胁迫影响的糖类物质；重金属如Pb等可通过与蛋白质的-SH基或其它基团的相互作用，改变其结构或功能，进而影响其合成代谢[21]；而一些水生生物肝脏中的糖原、蛋白质和脂肪合成代谢酶如天冬氨酸转氨酶AST、乳酸脱氢酶LDH和苹果酸脱氢酶MDH等的活性在重金属胁迫下也会增加[22]，以提高能量物质的代谢率防御重金属的胁迫作用。然而，在昆虫的研究中还未见相关报道，Cu2+胁迫对亮斑扁角水虻幼虫能量物质影响的具体机制还有待于进一步的研究。