卵穗山羊草1My亚基特异性分子标记开发

郑 柯，易滢瑾，赵来宾，刘冬梅，许 凯，郝 明，张连全，刘登才，甯顺腙

（四川农业大学小麦研究所，成都 611130）

小麦高分子量谷蛋白占胚乳总蛋白含量的10%左右[1]，尽管含量较少，但对小麦面粉加工品质有非常重要的作用。小麦高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）由位于第一同源群染色体长臂上的Glu-1位点编码[2]。每个Glu-1位点包含2个紧密连锁的基因，分别编码一个分子量较大的x-型亚基和一个分子量较小的y-型亚基[3]。HMW-GS种类和数量均影响小麦的加工品质。近年来，人们的生活水平逐渐提高，对小麦品质有了更高的要求。小麦HMW-GS遗传位点的遗传基础较窄，阻碍了小麦品质的改良[4]，向小麦转移新的HMW-GS显得尤为重要。

卵穗山羊草（Aegilops ovata L.，U°U°M°M°，2n=4x=28）是小麦遗传改良的重要基因源，其中U°来自小伞山羊草（Ae.umbellulata，2n=2x=14，UU），M°来自顶芒山羊草（Ae.comosa，2n=2x=14，MM）。卵穗山羊草分布很广，原产于地中海地区，中东以及俄罗斯和乌克兰的南部，具有抗旱、抗逆、耐瘠薄及高抗白粉病和条锈病等优点[5]。G.Monika[6]通过分析1Mg（1A），1Mg（1B）和1Mg（1D）代换系，表明Glu-Mg1可以提高小麦品质，其中1Mg（1A）代换系的效应最强。

SDS-PAGE是小麦高分子量谷蛋白最常用的鉴定方法，需要的设备以及试剂相对简单，结果直观；但分辨率较低，对分子量差异小的亚基难以区分。因此基于等位基因之间的DNA序列多态性，开发特异分子标记，具有选择快速、准确、成本低的特性，已成为追踪鉴定HMW-GS的重要技术手段。许多HMW-GS已开发有特异性分子标记，如1Dx5[7-8]、1Ax2[8]、1Bx7[9]、1Bx14 和 1Bx17[10]、1By18[11]、Glu-1Ssh[12]等。

1Mx和1My特异性分子标记有利于在转移其到小麦背景中的追踪鉴定，加速其在小麦品质遗传改良中的应用。本试验通过分析1My与1A、1B、1D、1U°、1M°染色体部分高分子量谷蛋白亚基编码基因序列，设计1My亚基特异性分子标记，以期为筛选含有1My小麦育种提供便利。

1 材料和方法

1.1 试验材料

卵穗山羊草（Aegilops ovata L.，U°U°M°M°，2n=4x=28）AS6，普通小麦异源2号和川麦41，卵穗山羊草-小麦1M°附加系（简称附加系）11份与其不含有1M°染色体的姊妹系（简称姊妹系）9份，为AS6/2/异源2号//川麦41 F7中筛选获得（未发表），48个普通小麦品种（系），普通小麦中国春作为SDS-PAGE对照材料。以上材料均保存于四川农业大学小麦所。所有材料的HMW-GS组成见表1。

表1 试验材料及高分子量谷蛋白亚基组成Table 1 Experiment materials and their HWM-GS compositions

1.2 试验方法

1.2.1 SDS-PAGE 分析

种子蛋白提取和SDS-PAGE分析参照Yan Z.等[13]的方法。采用不连续分离系统进行电泳，电泳检测时，取谷蛋白液3 μL点样。SDS-PAGE电泳条件为电压120 V，电流20 mA。电泳2 h 10 min后用染色液染色1 h，使用蒸馏水脱色，背景清晰后照相保存。亚基命名按照P.I.Payne[14]命名系统。

1.2.2 分子标记设计

参考Wei L.等[12]的方法，利用美国国家生物技术信息中心（NCBI）上登录的HMW-GS编码基因序列，用 DNAMAN7（Lynnon Biosoft，USA）进行多序列比对，结合手动调整，分析其序列之间的SNPs差异，设计1My特异性分子标记。

1.2.3 目标序列的克隆测序

采用CTAB法提取新鲜叶片的DNA[15]。用分子标记进行PCR扩增后，用1.0%琼脂糖进行电泳鉴定，获得的目标片段使用琼脂糖回收试剂盒（OMEGA，USA）回收，然后将目标片段用pMD19-T Vector Cloning Kit（Takara，Japan）进行连接，连接体系为：pMD19-T 载体 0.5 μL，SolutionⅠ4.5 μL，回收DNA产物100 ng，加入ddH2O至10 μL。反应液在16℃连接4 h，然后转化至DH5a感受态大肠杆菌。每个材料获得的阳性克隆选取3个以上送上海生工生物工程股份有限公司（Sangon Biotech，China）进行测序，序列比对在NCBI的BLAST中进行，多序列比对在 DNAMAN7（Lynnon Biosoft，USA）中进行。

2 结果与分析

2.1 试验材料HMW-GS表达情况

卵穗山羊草AS6有4个HMW-GS表达（图1），从上到下分别是 1Ux，1Mx，1Uy 和 1My[6]。1Ux 迁移率最小，小于1Dx2；1Mx与1Dx2具有相似或略小的迁移率；1Uy介于1Bx7和1Dx2之间，迁移率稍小于1Bx7；1My介于1By8和1Dy12之间，迁移率稍小于1Dy12。附加系含有一条与亲本AS6的1My具有相似迁移率的条带（图1箭头处），而姊妹系和普通小麦亲本异源2号和川麦41则没有这一条带。

图1 SDS-PAGE分析Figure 1 SDS-PAGE analysis

2.2 1My分子标记设计

下载 NCBI上收录的 1My（Genbank：KX375405.1）、1Dx2（Genbank：KF466259.1）、1Dy3（Genbank：KF466 260.1）、1Ax（Genbank：JQ007589.1）、1Bx13（Genbank：EF540764.1）、1Dy11（Genbank：EU528008.1）、1By16（Genbank：EF540765.1）、1Ay（Genbank：MF098417.1）、1Mx（Genbank：KX375404.1）、1Uy（Genbank：KX3754 07.1）和 1Ux（Genbank：KX375406.1）基因序列，用DNAMAN7进行多序列比对，发现了2个1My特异的SNP位点（图2）。利用这2个位点设计了一对PCR分子标记，上引物：5’-CGTGGCTCTCACCGTC GCTC-3’，下引物：5’-AAGATGTTACGCTTGGGTA G-3’。

图2 1My特异SNPsFigure 2 1My specific SNPs

2.3 1My亚基特异性分子标记的PCR扩增和验证

用设计的分子标记对附加系、姊妹系、亲本材料以及品种（系）进行PCR扩增，PCR反应体系为：2×Taq Plus Master Mix（Vazyme，China）12.5 μL，上下引物（10 μM）各 1 μL，模板 DNA 50～100 ng，加入ddH2O至25 μL。PCR程序：94℃预热5 min，94℃变性 30 s，63 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 40 s，共 30个循环，最后72℃总延伸10 min。扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行分离。试验设置3次重复。

与预期分析一致，除AS6和附加系材料均扩增出一条长度位于250 bp和500 bp之间的明亮条带，普通小麦亲本、姊妹系（图3）以及48个品种（系）材料均没有扩增出条带。

为进一步验证AS6和附加系扩增序列来自于1My编码基因，将AS6和附加系中扩增出的片段进行克隆测序，分别获得了一条356 bp的序列。这2条序列完全一致，且与1My参考序列（Genbank：KX375405.1）在匹配区域完全相同。

图3 1My特异性分子标记PCR扩增Figure 3 PCR amplification of 1My specific molecular marker

3 讨论与结论

通过开发和利用分子标记辅助选择，可以快速准确筛选目的基因，使得大量的材料可以在短时间内完成筛选，以节约时间和资源[8]。以目前的研究水平，小麦的品质无法通过简单的形态指标来进行鉴定。P.I.Payne等[2]通过 SDS-PAGE 将不同 HMW-GS分离，建立了HMW-GS品质评分系统，显示了不同亚基对品质的贡献不同。Glu-B1和Glu-D1位点的亚基对面团的强度影响显著[16-17]。1Dx5+1Dy10、1Bx7+1By8等被认为是优异的面包小麦亚基组合[18]。同时，近缘属种也是小麦多样化谷蛋白亚基的重要供体，如西尔斯山羊草（Aegilops searsii）1SS可以提高籽粒蛋白质的含量，质量以及面团强度[19]；高大山羊草（Aegilops longissima）1Sl的 HMW-GS 1S1x2.3*和1S1y16*，可以显著提高成熟种子中谷蛋白的含量[20]；中间偃麦草的Glu-1St#2x可以提高普通小麦的蛋白质含量、十二烷基硫酸钠沉淀值、溶剂保持力[21]。因而，将不同的亚基组合在一起可以满足小麦品质多样化的需求[22]；但是HMW-GS在SDS-PAGE中的迁移率并不总是与其实际的分子量一致，这种现象会对育种家产生误导[23]，因此分子标记辅助选择可以避免SDS-PAGE的缺点。本研究设计分子标记的PCR扩增结果与SDS-PAGE结果相一致，可以用来筛选含有1My的材料。

SNPs是有效的第三代分子标记和一个强大的辅助育种的标记[24]。不同HMW-GS的C-端非重复区和N-端非重复区高度保守[9]，主要差异存在于中央重复区[25]。本研究通过比对已公布的1My亚基编码基因序列与7个普通小麦谷蛋白亚基和外源1Mx、1Ux及1Uy编码基因序列，在1My编码基因的重复区发现2个特异的SNP，据此成功开发了一个1My特异性分子标记。该分子标记在48个普通小麦品种（系）、亲本以及不含有1My的姊妹系中无法扩增出条带，而在卵穗山羊草亲本及1M°附加系中均扩增出了一条明亮的条带，通过克隆该片段并测序确定其来自于1My。包含设计该分子标记时使用的参考谷蛋白亚基在内，该标记可能至少在18种高分子谷蛋白亚基的背景中能够用于鉴定是否含有1My，具有普遍适用性。同时由于谷蛋白x和y型亚基因紧密连锁，该标记也可以用于筛选含有1Mx的材料。