表达结核分枝杆菌ESAT-6-Ag85A基因的侵入型乳酸菌免疫特性研究①

刘 晶 张 赞 刘 洋 杨桂连 姜延龙 王春凤

(吉林农业大学动物科学技术学院，吉林省动物微生态制剂工程研究中心，动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，长春 130118)

结核病 (Tuberculosis，TB)是一种由结核分枝杆菌(Mycobacteria tuberculosis,MTB)引起的人兽共患的慢性传染病，目前仍然是一个主要的全球性健康问题,可累及全身多个器官，但以肺结核(Pulmonary tuberculosis，PTB)最为常见。目前广泛用于预防 TB 的唯一经过许可的疫苗就是卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin，BCG)，但只是在婴幼儿身上发挥作用[1]，在保护青少年和成年人的肺病中却受限，而且随着年龄的增长产生的记忆性免疫会降低[2]；BCG是全菌疫苗，可引起淋巴结肿大和化脓等异常反应，所以改造卡介苗和开发安全有效的新疫苗势在必行。ESAT-6是一个大小为6 kD的早期分泌靶抗原，是最具有免疫能力的特定靶向抗原，具有增强细胞免疫反应的能力。结核分枝杆菌中主要的保护性抗原是抗原85(Ag85),在对抗结核病中具有保护作用[3,4]。Ag85A是一种免疫显性的蛋白，可以增加Th1型免疫反应[5]，刺激IFN-γ的产生[6]。表达Ag85A和ESAT-6 融合蛋白的DNA疫苗能使小鼠产生有效的免疫反应[7]。

pValac是经过改造后的真核表达质粒，含有巨噬细胞病毒启动子(pCMV)和BGH polyA结构，同时具有大肠杆菌和乳酸菌复制子RepC 和RepA，因此也属于真核穿梭表达载体[8]。NC8-pSIP-409-FnBPA是具有侵入宿主细胞能力的侵入型乳酸菌。本实验的目的是在侵入型乳酸菌的基础上，转入表达ES85A抗原的真核质粒，构建双质粒表达的侵入型重组乳酸菌，该侵入型乳酸菌可作为口服DNA疫苗载体，在畜禽病毒性、寄生虫类疫病防控中有广阔的应用前景。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株及质粒载体 真核表达载体pValac、大肠杆菌TG1感受态、重组乳酸菌感受态NC8-pSIP-409和NC8-pSIP-409-FnBPA由本实验制备并保存。

1.1.2动物 健康的雌性BALB/c小鼠20只,5～6周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，随机分成4组，每组5只，4组依次为PBS、pValac/409(空载体组)、pValac-ES85A/409和pValac-ES85A/FnBPA。

1.1.3仪器和试剂 LSRFortessaTM流式细胞仪购自美国BD公司;Epoch2酶标仪购自美国Biotek;LSM710型共聚焦显微镜购自德国。普通质粒小提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒均购自康为世纪；PrimeSTAR Max Premix(×2)，限制性内切酶，T4 DNA连接酶，DL5000 marker，5×SDS buffer由宝生物(TaKaRa)公司提供；红霉素为Amresco公司分装；氯霉素购自EBT公司；电转杯由Bio-Rad公司提供；硝酸纤维素膜(NC膜)购自Whatman公司;Anti-FLAG抗体(鼠源)以及FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体购自康为世纪；HRP标记的山羊抗鼠的IgG抗体购自鼎国公司;低分子量蛋白质标准购自上海生物工程有限公司;流式抗体购自美国BD公司；ELISA试剂盒购自康为世纪；其他主要试剂为进口产品或国产分析纯产品。

1.2方法

1.2.1目的基因的序列分析及基因合成 根据GenBank登录的基因序列，选取酶切位点KpnⅠ和XbaⅠ，设计ESAT-6-Ag85A基因序列并送去苏州金维智生物科技有限公司进行合成。

1.2.2目的基因ESAT-6-Ag85A(ES85A)与真核表达载体pValac的连接 对pValac真核载体以及合成的质粒pUC57-ES85A分别采用KpnⅠ/XbaⅠ进行双酶切及胶回收，对回收产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。使用T4连接酶将基因ES85A和pValac进行16℃连接过夜，次日转化到E.coli TG1化学感受态细胞，并涂于含有氯霉素的LB平板(Cm的终浓度是10 μg/ml)上，挑取单克隆并使用摇床进行扩充培养，采用康为世纪的质粒小提试剂盒进行质粒提取，提取重组质粒，并对重组质粒进行酶切鉴定，酶切产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。对酶切切开的质粒送去吉林省库美生物科技有限公司进行测序。

1.2.3将构建好的真核质粒pValac-ES85A转染293T细胞 培养293T细胞,将培养状态好的细胞铺6孔和24孔(含有赖氨酸处理的细胞爬片)细胞培养板中，使用DMEM完全培养基调整细胞浓度为6孔：5.0×105/孔；24孔:2.0×105/孔,37℃ 5%CO2培养箱中孵育至细胞长至单层;使用Invitrogen的Lipofectamine 3000 Reagent转染试剂按照说明书进行转染，转染之后6孔补加2 ml和24孔补加1 ml完全培养基，37℃ 5%CO2培养箱中孵育48 h。

1.2.4使用Western blot检测目的蛋白的表达 收集转染后48 h的细胞沉淀，进行蛋白的抽提。首先，使用PBS漂洗细胞3次；其次，每孔加入300 μl 预冷的Mammalian protein Extraction Reagent (抽提细胞前2～3 min,按1∶99比例加Protease Inhibitor cocktail),在冰上用枪头吹打细胞，将裂解液转移到离心管中，冰浴20 min，充分裂解；最后，收集裂解液，14 000 g离心10 min，收集上清，加入相应的5×SDS loading buffer混匀,沸水中煮沸10 min，12 000 g 离心10 min备用;根据TaKaRa商品目录，分别配置12%分离胶(3 ml)和5%浓缩胶(2 ml)，按照之前的方法进行配胶以及Western blot检测[9]。第一抗体是康为世纪的鼠源Anti-FLAG标签抗体,二抗是HRP标记的山羊抗小鼠IgG；最后使用ECL显色试剂盒进行显色。

1.2.5使用间接免疫荧光检测目的蛋白的荧光表达情况 转染后的24孔板细胞，使用PBS漂洗细胞20 min,每孔加入一定量的4%多聚甲醛室温固定20 min，PBST(0.5%Tween 20)洗3次，每次5 min；每孔加入500 μl 的0.5% Triton X-100，室温放置30 min，再次使用PBST进行洗涤细胞;使用2%BSA封闭液37℃恒温箱封闭30 min，每孔加入稀释后的鼠源Anti-FLAG标签抗体，4℃孵育过夜;PBST洗3次,每孔加入一定量的FITC标记的山羊抗小鼠IgG，37℃水平摇床避光孵育30 min;PBST洗3次，加入细胞核染料DAPI，室温避光染色15 min,PBST洗3次，最后使用抗荧光衰减剂进行封片，使用共聚焦显微镜进行观察。

1.2.6真核质粒pValac-ES85A电转侵入型乳酸菌 取10 μl重组质粒pValac-ES85A分别加入到NC8-pSIP409和NC8-pSIP409-FnBPA感受态中，轻缓混匀，移入预冷的0.2 cm间距的电击杯内，冰浴5 min 后，放入电转化仪(2.5 kV，6 ms)中进行电击，电击结束后，加入800 μl的MRS培养液中，再加入150 μl的蔗糖溶液(蔗糖浓度0.5 mol/L)，混匀缓慢吸到1.5 EP管中，30℃水浴3 h；离心，全部涂于含有Em和Cm (终浓度都是10 μg/ml)的双抗性 MRS 固体培养基上，30℃厌氧条件下培养至长出状态良好的单个菌落。挑取单克隆接种于含 Em和Cm的双抗性MRS培养液中，30℃厌氧条件下过夜培养，菌液浑浊的就应该是阳性菌，保存菌种，分别命名为pValac-ES85A/409 和pValac-ES85A/FnBPA，存放于-80℃用于后期动物实验。

1.2.7动物实验 在第0、1、2、14、15、16、28、29、30天进行免疫，免疫剂量为109 CFU/(100 μl·只)，采用口服灌胃的方式，PBS组免疫等量的PBS。在免疫后的第42天，处死小鼠，眼球采血，制备血清，-80℃备用。取小鼠的脾脏，按照文献[10]中的方法制备脾脏的单细胞悬液。同时加入鼠源的APC标记的CD11c、PerCP-Cy5.5标记的CD80以及PE标记的CD83流式抗体，室温避光孵育30 min,使用PBS洗2次，4℃，2 000 r/min离心5 min,留细胞悬液约200 μl，移到流式管中，使用流式细胞仪进行检测。使用ELISA试剂盒检测小鼠血清中细胞因子IFN-γ和IL-4的表达情况。

1.3统计学处理 使用GraphPad Prism 5软件进行统计分析，对数据的显著性差异进行评估，通过标准平均误差(SEM)对多组间数据采用单因素方差分析，以P< 0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1目的基因ES85A和pValac的酶切片段及重组质粒酶切鉴定结果 使用KpnⅠ和XbaⅠ对载体和目的片段进行双酶切回收，可见成功回收到3 666 bp 的pValac载体片段及1 450 bp的ES85A片段，如图1A，对其构建之后的重组质粒进行双酶切鉴定，结果如图1B。重组质粒的测序结果经NCBI上的BLAST比对，同源性达99%以上。

2.2Western blot检测结果 采用Western blot检测重组融合蛋白ES85A的表达情况，收集转染293T细胞48 h后的细胞沉淀进行检测，可见在53 kD处出现清晰可见的蛋白条带，而阴性对照中未见到任何的蛋白条带，如图2。

2.3间接免疫荧光检测结果 将构建好的真核质粒pValac-ES85A转染293T细胞，48 h后使用间接免疫荧光标记目标蛋白，使用共聚焦显微镜观察(×400)，如图3A所示，转染空载体pValac质粒的细胞中，没有任何的蛋白表达；转染pValac-ES85A质粒的细胞中可以看出蛋白ES85A的大量表达(图3B)；图3C中是转染阳性质粒pValac-gfp，可见有大量的gfp表达。

图1 ES85A和pValac的酶切片段及重组质粒酶切鉴定Fig.1 Identification of ES85A and pValac by double digestion as well as recombinant plasmid by double digestionNote: Fig.A.1.Product of pValac vector (KpnⅠ/XbaⅠ) by double digestion；2.Product of ES85A gene (KpnⅠ/XbaⅠ) by double digestion;Fig.B.1.Identification of pValac-ES85A by double digestion;M.DL5000 marker.

图2 Western blot检测ES85A融合蛋白在293T细胞中的表达Fig.2 Expression of ES85A fusion protein in 293T cells by Western blotNote: M.Low molecular weight protein marker;1.Expression of control vector pValac in 293T cells;2.Expression of pValac-ES85A in 293T cells.

图3 共聚焦显微镜观察转染293T细胞48 h后ES85A蛋白的表达Fig.3 Expression of ES85A protein after transfection 293T cells 48 h was observed by confocal microscopeNote: A.Negative control：pValac；B.Plasmid pValac-ES85A of transfection;C.Positive control:pValac-gfp.Cell nucleus was labeled using blue and expressing protein or gfp were labeled by green.The blue and green were merged in the pictures.

2.4流式细胞术检测表达ES85A的侵入型乳酸菌对小鼠DCs亚群的影响 使用流式抗体CD11c、CD80和CD83标记处理好的脾细胞，使用流式细胞仪进行检测，检测结果如图4所示，可见与空载体组相比，表达ES85A蛋白的重组乳酸菌组更能促进小鼠脾细胞中CD11+CD80+(P<0.001) 和CD11+CD83+(P<0.01)的表达，进而促进树突细胞的分化和成熟。

2.5ELISA检测结果 收集免疫后第42天的小鼠血清，使用ELISA检测小鼠血清中细胞因子IFN-γ和IL-4的表达情况。结果显示与空载体组相比，表达ES85A的重组乳酸菌中IL-4的含量显著升高，尤其是表达ES85A的侵入型乳酸菌的效果更显著(P<0.05)，但IFN-γ含量各组之间没有显著的差异，如图5。

图4 流式细胞术检测小鼠脾细胞中DCs亚群的变化Fig.4 Detection of DCs subsets in spleen cells from mice using flow cytometryNote: A.The DC gating strategy；B.Expression levels of CD11+CD80+and CD11+CD83+were analysed by flow cytometry.***.P<0.001,**.P<0.01,*.P<0.05.

图5 ELISA检测小鼠血清中细胞因子IL-4和IFN-γ的表达Fig.5 Expression of cytokines IL-4 and IFN-γ in serum from mice were detected by ELISANote: A.Expression of IL-4 in serum;B.Expression of IFN-γ in serum.**.P<0.01,*.P<0.05.

3 讨论

乳酸菌属于益生菌，可以作为DNA疫苗的递送载体，但其递送效率不高[11]，为了提高递送效率，我们构建了表达FnBPA的侵入型植物乳杆菌NC8[12]。这种新型的乳酸菌递送载体可以提高表达外源抗原的递送效率。结核病是全球健康的一个大问题，在结核分枝杆菌中ESAT-6和Ag85A基因在对抗小鼠结核病中起到了保护作用[7]，对其DNA疫苗载体的选择，表达FnBPA的侵入型乳球菌作为DNA疫苗递送载体成为研究的热点。研究表明编码Ag85A抗原的侵入型乳球菌能增强细胞因子IFN-γ、IL-6 和 TNF-α的表达水平[13]，编码ESAT-6抗原的侵入型乳球菌能提高细胞因子IL-17的分泌[14]，并且重组的结核杆菌Ag85A-ESAT-6融合蛋白在原核表达系统中能成功表达并且具有生物活性[15]。本文的目的是在现有的表达FnBPA的侵入型植物乳杆菌NC8作为DNA疫苗递送载体的基础上，构建了表达ESAT-6-Ag85A抗原的侵入型乳酸菌。树突状细胞(DCs)属于抗原递呈细胞，能够将抗原递送给T细胞，最后引起一系列的免疫反应，因此我们对树突状细胞的表型进行了检测。将构建好的表达ES85A的侵入型乳酸菌免疫BALB/c小鼠，检测DCs亚群CD80和CD83的表达，结果表明ES85A蛋白的表达能促进DCs的分化和成熟，尤其是以侵入型乳酸菌为递送载体的效果更好。这或许是因为表达FnBPA的侵入型乳酸菌由于具有侵入细胞的能力，进而增加了与DCs的结合效率。下一步的工作将会进一步研究表达ES85A蛋白的侵入菌株对动物机体免疫细胞的影响，为后期研制抗结核病的DNA的疫苗奠定了良好的基础。