线性探针技术检测肺结核患者耐药情况临床评价

侯 婧，韩 ，张 艳，孟 婧

（安徽省胸科医院，安徽 合肥 230022）

耐药肺结核患者的治疗周期长、治疗成本高、治愈率低，该病患者的增多[1]，进一步增大了传播概率，也加重了社会的经济负担。然而，传统的罗氏培养法培养结核分支杆菌需要8周[2]，进一步进行药物敏感性试验(简称药敏试验)诊断约需3个月，无法满足及时诊断和早期合理用药的需要[3]。线性探针（HAIN）技术通过对耐药相关基因的PCR扩增和反向杂交，对利福平的耐药基因rpoB和异烟肼的耐药基因KatG及inhA进行检测，从而可判断结核分枝杆菌对利福平、异烟肼的耐药性，并能在24 h内上报结果，已被世界卫生组织（WHO）推荐为一线抗结核药药敏试验的“金标准”[4]。本研究中以结核分枝杆菌的罗氏培养和绝对浓度药敏法为“金标准”，对HAIN技术检测利福平和异烟肼耐药性的效果进行评价，从而评估HAIN技术用于抗结核治疗的临床价值。现报道如下。

1 资料与方法

1．1 一般资料

选取我院2016年1月至6月痰抗酸杆菌涂片阳性的住院患者 251例，年龄 15～85岁，平均（47．67±18．33）岁；男 187 例（74．50% ），平均年龄（50．17 ±17．32）岁 ；女 64 例 （25．50% ），平 均 年 龄 （40．39±19．40）岁。

1．2 试剂及仪器

罗氏培养与药敏试验使用珠海贝索生物技术有限公司固体罗氏培养基，结核分枝杆菌抗原采用杭州创新生物检控技术有限公司试剂盒检测，并应用Haier公司HR50-ⅡA2生物安全柜试验。扩增及杂交选用德国Hain Life Sciences公司的 GeneType MTBDR-Plus1．0 Kit试剂盒。DNA杂交仪选用梅里埃公司的GT-Blot 48全自动微生物检测系统。严格按照试剂盒及相关仪器配套说明书进行操作。

1．3 方法

患者晨起立即用清水漱口，采集其漱口后深咳出的脓样、干酪样或脓性黏液样性质的痰液标本2份，一份采用罗氏培养及药敏试验检测，一份应用HAIN技术检测。

传统罗氏培养及药敏试验：痰标本经2倍于标本量的消化液（4%氢氧化钠）进行前处理，然后接种到酸性罗氏培养基培养。用接种环取一环培养基上的菌落，研磨后与标准麦氏管比对，制成质量浓度为1 g／L的菌悬液，梯度稀释为10-2g／L和10-4g／L，分别接种含异烟肼（0．1 μg ／mL）和利福平（0．2 μg ／mL）的药敏试验培养基，放入细菌培养箱中，37℃培养6～8周，观察结果。

HAIN技术检测：利用超声波水浴破坏细菌，提取DNA；应用热启动Taq酶扩增目的DNA片段；将PCR扩增产物与试纸条上固定的探针进行杂交显色；利用酶显色反应对结果进行判读。以罗氏培养和药敏试验作为“金标准”，检测HAIN技术下药物的耐药程度、敏感程度分别计算其敏感度、特异度。

1．4 统计学处理

采用SPSS 13．0统计学软件分析，耐药率比较采用χ2检验。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

结果见表1至表2。以罗氏法为标准，HAIN技术对利福平及异烟肼耐药检测的灵敏度分别为87．69%和52．73%，特异度分别为 90．86%和 87．24%。

表1 HAIN法与罗氏法耐药性检测结果比较[例（%）]

表2 HAIN法与罗氏法药敏试验结果比较（例，n＝251）

3 讨论

耐多药（同时对利福平和异烟肼耐药）结核病具有诊断难、治疗难、传播风险大的特点，是我国当前结核病控制的重点和难点。早期诊断可尽早控制耐药结核病的传播，同时能及时给予合理、有效的抗结核治疗。传统的罗氏培养法检测结核分枝杆菌的药物敏感性耗时长、工作量大，且在耐药性检测期间，只能根据经验应用抗结核药物，可能导致实施不合理的抗结核治疗方案。显然，寻找快速检测结核分枝杆菌耐药性的方法已成为耐药结核病控制的关键环节[5]。基因型方法在检测速度、操作标准化、潜在高通量及较低的生物安全条件等方面具有较大优势，更适于大规模检测耐药结核[6]。HAIN技术能通过进行反向探针杂交技术快速检测样本中的结核分枝杆菌复合群（MTBC），并通过同时检测rpoB，katG，inhA 3种基因，可在较短时间内检测利福平和异烟肼的耐药性，近几年已在全世界广泛应用[7-9]，该检测整个周期仅为24 h，能快速得到耐药性结果，确保更多结核病患者能得到快速、准确的诊断和治疗[10]。

本研究中采用HAIN技术对不同性别及全部痰抗酸杆菌涂片阳性肺结核患者利福平、异烟肼的耐药性进行检测并与罗氏培养及药敏试验“金标准”进行比较，差异均无统计学意义（P＞0．05），说明2种检测方法具有较好的一致性。但本研究中HAIN技术检测利福平、异烟肼耐药的敏感度及特异度均低于屈亚虹等[11]、李强等[12]报道的结果。究其原因，一方面，本研究中采用的是痰标本直接检测，而其他研究多采用实验室分离菌株进行检测；另一方面，本研究中纳入样本数量较少，结果可能存在一定的选择偏倚；此外，分子生物学技术对标本质量的要求较高，样本中结核分枝杆菌数目较少或样本中存在抑制DNA扩增的物质等，均可能影响检测效果[13]。

本研究中，少数患者利福平耐药检测结果与文献报道不一致，考虑原因为存在rpoB以外的基因突变[14]，呈假阴性；另外，部分结核菌株的rpoB基因突变位点为沉默或无效基因，此类基因不表达或低表达[15]，呈假阳性。

本研究中，HAIN技术对异烟肼耐药性检测的灵敏度及特异度均明显低于利福平。考虑可能是由于结核菌对利福平耐药仅由rpoB单基因突变引起，而katG，inhA，ahpC等多个基因突变均可导致异烟肼的耐药，HAIN技术仅检测katG和inhA 2个基因判断异烟肼的耐药性，对 ahpC等其他可能导致耐药的基因未进行检测。有研究表明，ahpC突变可导致自身基因表达增强，进而补偿KatG基因突变所导致的过氧化氢-过氧化物酶的缺乏，异烟肼活化不受影响，表型为敏感[16]。HAIN技术检测的利福平耐药率高于罗氏培养法，可能由于HAIN技术结果由肉眼直接读出，会造成主观偏倚[12]，同时操作过程中可能造成污染导致假阳性[17]。两种检测方法所得耐药率均高于国内全国结核病耐药性基线调查结果（8．32%）[18]，考虑可能是由于我院为安徽省的结核病诊疗中心，收住的复治及重症肺结核患者较多，故耐药率较高。

综上所述，HAIN技术诊断的准确性、敏感度和特异度均较高，且能用于快速判断利福平、异烟肼的耐药性，可为早期发现耐多药肺结核提供诊断依据，具有较大的临床意义。临床工作中在等待罗氏培养结果期间，可以HAIN技术作为辅助检测手段，从而让患者尽早得到合理、有效的抗结核治疗。