山楂药材黄酮类成分毛细管电泳指纹图谱研究

陈宝龙，郑朝华，陈玉英

（1．河南省正骨研究院，河南 洛阳 471002； 2．中国药科大学分析化学教研室，江苏 南京 210009）

中药山楂有行气散瘀功效[1]，临床治疗关节扭伤和红肿热痛效果良好[2-3]。山楂所含山楂总黄酮在体内外均能抑制血小板聚集，山楂叶醇提物（主要为黄酮类成分）对模型小鼠有抗炎镇痛作用，黄酮类代表成分金丝桃苷和芦丁有显著的抗炎镇痛作用[4-7]。山楂在我国分布广泛，成分及含量不尽相同，药效也有差异。为控制药材和制剂质量，保证药效，需对山楂中的化学成分物质群进行控制[8]。本研究中依据《中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南（试行）》的要求，利用毛细管电泳（CE）技术建立山楂药材黄酮类成分的指纹图谱，考察该图谱用于控制山楂药材质量的可行性，并为其质量控制标准的建立进行有益探索。现报道如下。

1 仪器与试药

仪器：D／ACE5500型毛细管电泳仪[配有二极管阵列检测器（DAD）](美国Beckman公司)；毛细管柱（河北永年光纤厂，总长 57 cm，有效长度 50cm，内径 50 μm，未涂渍）。

试药：10批次山楂药材来自山东济南，经药物室李军研究员鉴定为蔷薇科植物山里红 Crataegus pinnatifida Bge．var．major N．E．Br的干燥成熟果实；金丝桃苷对照品（≥95%）购于安徽DETLA天然有机化合物信息中心；十二烷基硫酸钠（SDS，Sigma公司）；甲醇、乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2．1 检测条件

电泳模式：胶束电泳毛细管色谱（MECC）模式；缓冲液：NaH2PO4-Na2B4O7-SDS（浓度分别为 20，40，40 mmol／L，pH＝4．50）；毛细管柱处理：依次用重蒸水、0．1 mol／L氢氧化钠、重蒸水冲洗毛细管柱各10 min，缓冲液冲洗 5 min，平衡20 min，缓冲液冲洗5 min，高压进样6 s，25 kV 电压分析样品 60 min；检测波长：210 nm。

2．2 溶液制备

采用前期试验确定的黄酮类成分提取方法[9]，称取山楂药材样品粉末1．25 g，加10倍量95%乙醇，60℃、250 W超声提取 45 min，滤过，残渣加 6倍量 95%乙醇，同法超声提取，滤过，残渣加4倍量95%乙醇，再次同法超声提取，滤过，合并滤液，转至25 mL容量瓶中，加95%乙醇定容，摇匀；移取3 mL提取液，加热挥干溶剂，加 1 mL 缓冲液超声溶解，放置 30 min，经 0．45 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。取对照品金丝桃苷适量，用缓冲液超声溶解，放置 30 min后，经 0．45 μm微孔滤膜滤过，作为对照品溶液（质量浓度为25 μg／mL）。

2．3 方法学考察

空白及对照品试验：分别取缓冲液、金丝桃苷对照品溶液，压力进样，记录色谱图。结果见图1。

参照物选择：经出峰时间和DAD比对，确认8号峰为金丝桃苷峰，其峰面积较大、峰形好、峰纯度高，故被选为参照物。

精密度试验：取供试品溶液（批次 5），连续进样5次。结果峰面积百分比≥10%的共有峰相对峰面积的RSD为2．30%（＜5%），表明仪器精密度良好。

重复性试验：精密称取供试品（批次 5）6份，照2．2项下方法制备供试品溶液，进样测定。结果峰面积百分比≥10%的共有峰相对峰面积的 RSD为2．42%（＜5%），表明方法重复性较好。

图1 空白及对照品试验色谱图

稳定性试验：取同一供试品溶液（批次5），分别在室温下放置 0，4，8，12，16 h时进样。结果峰面积百分比≥10%的共有峰相对峰面积的 RSD为 2．32%（＜5%），表明供试品溶液在室温下放置16 h内稳定。

2．4 毛细管柱处理

新毛细管柱用 1 mol／L盐酸、重蒸水、1 mol／L氢氧化钠、重蒸水交替冲洗处理，充满氮气保存待用；每天试验开始前用1 mol／L氢氧化钠冲洗5 min，重蒸水冲洗10 min，缓冲液冲洗30 min；试验结束前用 1 mol／L氢氧化钠冲洗 20 min，重蒸水冲 20 min，充满氮气，保存待用。

2．5 指纹图谱的建立及分析

指纹图谱的建立：根据10批次山楂药材样品的CE检测结果所给出的相关参数，比较图谱可知，有16个共有峰，其中，金丝桃苷峰（8号峰）峰面积较大，纯度高，被选为参照峰。在共有峰中只有15号峰的峰面积大于总峰面积的10%，因此只考虑15号峰的峰面积比值，其余各共有峰均按其相对保留时间进行定性。山楂药材样品的 CE指纹图谱见图2。10批次山楂药材样品中黄酮类成分CE指纹图谱共有峰（1～16 号峰）的相对保留时间比分别为 0．566，0．585，0．637，0．674，0．742，0．769，0．861，1．000（s），1．079，1．177，1．248，1．500，1．532，1．605，1．683，2．317。 指纹图谱峰面积百分比≥10%的共有峰(峰15)的相对峰面积见表1。

图2 山楂药材黄酮类成分的CE指纹图谱

指纹图谱全谱相似度比较与分析：根据《中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南（试行）》的要求，采用计算机辅助相似性评价系统，比较10批次山楂药材样品黄酮类成分CE指纹图谱全谱相似度。技术参数见表2。

表1 10批次山楂药材样品中峰15的相对峰面积

表2 10批次山楂药材样品的相似度评价技术参数

3 讨论

CE是利用不同物质在处于高电场且充满溶液的毛细管中迁移速率不同实现彼此分离，具有柱效高、分离快、适用样品范围广、样品使用量少的优点，在许多领域已成为重要的分析手段。中药有效成分多、含量低的特点适合采用CE方法进行质量控制。在本研究中，分析条件的选择和优化是关键。

介质选择：山楂药材中要考察的有效部位为黄酮类成分，根据其结构大多含有邻位酚羟基的特点，并参考文献[10-12]，选择硼砂水溶液作为基本电解质，以利用硼砂与邻位酚羟基的络合作用使不同成分淌度差异拉大，使分离度增加，提高CE的选择性。

对照品选择：在已知山楂黄酮类成分中，金丝桃苷含量高，故以金丝桃苷作为对照品。

分析样品溶液制备：CE是一种高灵敏度的分析方法，为符合MECC的分析要求，使分析样品在进样前与缓冲液中的组分形成稳定的胶束包裹物，同时消除分析过程中分析样品溶液时产生的扰动，提高分离效率，分析样品溶液采用缓冲液制备。

检测波长选择：对供试品溶液进行190～800 nm紫外-可见吸收光谱扫描和DAD成分检测，因210 nm波长处黄酮类成分有显著吸收，且检测到的峰多，分离度较好，故选定210 nm为CE测定波长。

CE分析模式选择：为获得最佳的山楂药材CE指纹图谱，先后考察了MECC相CZE（毛细管区带电泳）和pH梯度法3种CE分析模式。结果显示，采用缓冲液制备的供试品溶液在MECC模式得到的CE图谱较另两种模式图谱出峰多，峰之间的分离度相对较好，基线相对较平稳，故选用MECC分析模式。

参照物选择：由加入一定量金丝桃苷对照品的供试品溶液的CE图谱确定8号峰为金丝桃苷峰，其峰面积大、峰形好、峰纯度高，故被选为参照物。

测定条件优化：为获得最佳的山楂药材CE指纹图谱，对 CE 分析条件的电压（10，15，20，25，30 kV）、进样方式（压力进样、电压进样）、缓冲液pH（通过加入 NaH2PO4调控 pH 为 4．0，4．5，5．0，6．0）、缓冲液浓度（10∶20∶20，10∶20∶40，20∶40∶40，20∶40∶30，mmol／L），有机添加剂（异丙醇、乙腈或不添加）进行了优化考察，通过比较图谱，确定了本研究中采用的测定条件。

综上所述，虽然山楂药材黄酮类成分CE指纹图谱研究未见报道，但本研究中成功建立的CE指纹图谱技术为山楂质量控制提供了参考。