大孔吸附树脂分离纯化了哥王中西瑞香素的工艺*

赖红芳，潘立卫，黄秀香，覃光全

(河池学院化学与生物工程学院，宜州 546300)

了哥王(WikstroemiaindicaLinn，别名Indianstringbush)属瑞香科荛花属植物[1-2]，有黄皮子、南岭荛花、小金腰带等别称。其性味苦、辛微温、毒性较大，有清热解毒、消肿散结、逐水散瘀等功能，具有抗肿瘤、抗炎镇痛、抗病毒等多种药理作用[3]。人们常用了哥王与其他中草药配伍，用于治疗坐骨神经痛、淋巴结肿大、软组织损伤、带状疱疹后遗神经痛、风湿痛、恶性肿瘤、肝硬化等症[4]，因主治男性病症疗效好，有利于男性，因此有了哥王之称。目前，了哥王检测出多种化学成分，分别是山萘酚、牛蒡苷元、南荛酚、松脂酚、芫花素[5]、西瑞香素[6]等。其中西瑞香素为香豆素类化合物，别称了哥王素，是了哥王药材中主要成分，具有抗病毒、抗炎、抗肿瘤[7-8]等药理作用，也是民间药物穿王消炎片、了哥王片等主要成分和相关药品质量的主要考察指标成分之一[9]。

大孔吸附树脂不溶于酸、碱及各种有机溶剂，具有化学性质和物理性质稳定性高、吸附速度快、选择性好、比表面积大和吸附量大等优点[10]，是一类具有很好吸附效果的有机高分子聚合物。近年来，大孔吸附树脂在分离纯化多酚、黄酮类多种活性物质的应用越来越普遍[11]。目前对了哥王中西瑞香素的研究主要是分离纯化方法、结构及含量测定等[12-13]，关于其分离纯化工艺笔者未见报道。本实验选用8种不同型号大孔吸附树脂，利用静态吸附从8种不同型号大孔吸附树脂中筛选出一种吸附-解吸效果最好的大孔吸附树脂，通过优化吸附与解吸纯化工艺，考察大孔吸附树脂对了哥王中西瑞香素的纯化效果的影响，为开发以西瑞香素为主的药品及功能性食品提供理论依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 Agilent 1260型高效液相色谱仪(四元泵，VWD 检测器，柱温箱，自动进样器)、Agilent 1260 series色谱工作站、Agilent 8453型紫外-可见分光光度计(美国安捷伦公司)；KQ250DE超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；AUW220D型天平(日本岛津公司，感量：0.01 mg)；MilliporeD-Q3超纯水机(美国密理博公司)。

1.2药材与试剂 了哥王购于玉林中草药市场，经河池学院化学与生物工程学院邓晰朝副教授鉴定为了哥王(WikstroemiaindicaLinn)根茎。西瑞香素标准品(陕西华昱生物科技有限公司，批号：51118，含量≥99.5%)；色谱纯甲醇(美国Tedia公司)；大孔吸附树脂HPD600、HPD450、D4020、AB-8、DM130、HP20、D101、NKA-9(郑州华溢科技新材料股份有限公司)；无水乙醇及磷酸为分析纯。

2 实验方法

2.1西瑞香素的测定条件 高效液相色谱仪：色谱柱为Kramasil C18；流动相为甲醇-0.1 %磷酸溶液(55：45)；流速为0.6 mL·min-1；紫外光检测波长为346 nm；柱温为28 ℃；进样量为10 μL。

2.2标准曲线的绘制 精密称取西瑞香素标准品3 mg于小烧杯中，加入70%乙醇15 mL超声，使之溶解，然后转移到50 mL量瓶中，再用70%乙醇定容，摇匀，即得60 μg·mL-1的标准品储备液。分别用移液管移取标准品储备液，体积为0.5，1.0，3.0，5.0，7.0，9.0 mL，置于比色管中，加70%乙醇定容至10 mL，摇匀，过孔径0.45 μm有机膜，在“2.1”项条件下测得不同浓度西瑞香素标准对照品溶液的峰面积。以西瑞香素质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

2.3了哥王中西瑞香素超声提取 将处理好的了哥王根茎切成片，粉碎后保存，精密称量了哥王粉末10 g置于250 mL锥形瓶中，以料液比为1：20，提取温度为40 ℃，功率为90 W，提取溶剂为70%乙醇，超声时间为0.4 h，超声提取2次，合并2次滤液，旋转蒸发去除部分溶剂，得了哥王中西瑞香素粗提液，冷藏备用。

2.48种大孔树脂静态吸附与解吸的筛选

2.4.1静态吸附实验 分别称取8种大孔树脂树脂2.0 g于250 mL锥形瓶中，加入浓度为46.3 μg·mL-1样品溶液25 mL，常温，放在摇振床上振荡24 h，转速180 r·min-1，滤过，滤液定容至25 mL，溶液过孔径0.45 μm有机膜滤过，用“2.2”项的条件测定滤液中西瑞香素的峰面积，代入回归方程计算西瑞香素的质量浓度，根据以下公式(1)计算大孔树脂吸附率，对大孔树脂的吸附性能进行筛选。

公式(1)：A为吸附率(%)；C0为西瑞香素的起始质量浓度(mg ·mL-1)；V0为起始体积(mL)；C1为吸附后西瑞香素的质量浓度(mg ·mL-1)；V1为吸附溶液体积(mL)。

2.4.2静态解吸实验 将充分吸附后的大孔树脂用纯化水冲洗至大孔树脂表面无提取残留液，然后抽干，再加入70%乙醇溶液25 mL，常温，置于摇床上振荡24 h，转速180 r·min-1，充分解吸后过滤，滤液定容至25 mL，溶液过孔径0.45 μm有机膜，用“2.2”项条件测定滤液中西瑞香素的峰面积，代入回归方程计算西瑞香素的质量浓度，按公式(2) 计算解吸率，对大孔树脂解吸能力进行筛选。

公式(2)中：B为解吸率(%)；C0为西瑞香素的起始质量浓度(mg ·mL-1)；V0为起始体积(mL)；C1为吸附后西瑞香素的质量浓度(mg ·mL-1)；V1为吸附溶液体积(mL) ；C2为解吸液中西瑞香素的质量浓度(mg ·mL-1)；V2为吸附溶液体积(mL)。

富集回收率=吸附率×解吸率。

2.5大孔树脂HPD600对了哥王中西瑞香素纯化工艺的吸附优化

2.5.1上样质量浓度的考察 称取5份预先处理好的大孔树脂HPD600 3.0 g，湿法装柱。将西瑞香素质量浓度分别为39.3，48，61.7，86.4，144 μg·mL-1的了哥王粗提取液15 mL，以相同体积流速通过大孔树脂树脂柱滴下，完全吸附后，冲洗干净，定容，溶液经孔径0.45 μm有机膜滤过，用“2.2”项的条件测定后计算吸附率。

2.5.2上样体积流速的考察 称取5份预先处理好的大孔树脂HPD600 3.0 g，湿法装柱。选取西瑞香素质量浓度约90 μg·mL-1的了哥王粗提取液30 mL上柱，以不同体积流速0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL·min-1通过大孔树脂滴下，分别收集流出液，冲洗干净，定容，溶液经孔径0.45 μm有机膜滤过，用“2.2”项的条件测定后计算吸附率。

2.5.3上样体积的考察 称取预先处理好的大孔吸附树脂HPD600 3.0 g，湿法装柱，选取西瑞香素约为90 μg·mL-1的了哥王粗提取液90 mL，进行动态吸附。样液加入流速为1.5 mL·min-1，通过大孔树脂滴下，分段收集流出液，流速同样为1.5 mL·min-1，每份5 mL，收集18份。溶液经过孔径0.45 μm有机膜，用“2.2”项条件测定后计算吸附率。

2.6大孔吸附树脂HPD600对了哥王中西瑞香素纯化工艺的解吸优化

2.6.1洗脱剂体积分数的考察 称取5份处理的大孔吸附树脂HPD600 3.0 g，湿法装柱，量取西瑞香素浓度约90 μg·mL-1样品液45 mL，流速1.5 mL·min-1进行动态吸附，吸附完全之后，先用水10 mL冲洗，再分别以50%，60%，70%，80%，90%乙醇各30 mL进行洗脱，收集溶液，定容，溶液过孔径0.45 μm有机膜滤过，用“2.2”项条件测定后计算解吸率。

2.6.2洗脱剂体积流速的考察 称取5份处理好的大孔吸附树脂HPD600 3.0 g，湿法装柱，取西瑞香素浓度约为90 μg·mL-1的样品液45 mL，流速为1.5 mL·min-1进行动态吸附，吸附完全之后，先用水10 mL冲洗，再用90%乙醇10 mL分别以0.5，1.5，2.5，3.5，4.5 mL·min-1流速滴下，收集溶液，定容，溶液经孔径0.45 μm有机膜滤过，用“2.2”项条件测定后计算解吸率。

2.6.3洗脱剂用量的考察 称取预先处理好的大孔树脂HPD600 3.0 g，湿法装柱，取样品液40 mL，含西瑞香素90 μg·mL-1，流速为1.5 mL·min-1，进行动态吸附，吸附完全后，先用水10 mL冲洗，用90%乙醇以1.5 mL·min-1流速进行解吸，每5 mL 流出液为1管收集，直到流出液接近无色时，终止收集。溶液过孔径0.45 μm有机膜滤过，用“2.2”项条件测定后计算解吸率。

2.7验证实验

2.7.1验证吸附实验 称取5份预先处理好的大孔树脂HPD600 3.0 g，湿法装柱， 按吸附单因素实验找出的最佳实验条件进行动态吸附，吸附完全后，先用水10 mL冲洗，收集溶液，溶液过孔径0.45 μm有机膜滤过，用“2.2”项的条件测定后计算吸附率。

2.7.2验证解吸实验 采用“2.7.1”项抽干的大孔树脂按解吸单因素找出的最佳实验条件进行洗脱，收集其溶液，溶液过孔径0.45 μm有机膜滤过，用“2.2”项的条件测定后计算解吸率及富集回收率。合并洗脱液，制成了哥王西瑞香素粉末，计算纯度。

P(%)=C2V2/M×100 (3)

式中：P为样品中西瑞香素的纯度；C2为洗脱液中西瑞香素浓度(mg ·mL-1)；V2为洗脱液体积(mL)；M为西瑞香素样品的质量(干重，mg)[14]。

3 结果

3.1西瑞香素标准品和样品高效液相色谱图 对西瑞香素标准品的高效液相色谱图及了哥王样品溶液的高效液相色谱图进行分析，西瑞香素出峰时间为4.9 min，其峰型对称，分离效果好，结果见图1。

A.西瑞香素标准品；B.了哥王提取液

图1西瑞香素标准品和了哥王提取液的高效液相色谱图

A.dephnoretin standard;B.WikstroemiaindicaLinn extraction solution

Fig.1HPLCchromatogramofdephnoretinstandardandWikstroemiaindicaLinnextractionsolution

3.2标准曲线绘制 以西瑞香素质量浓度作为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果回归方程为A=61.811X-74.102，R2=0.999 7，A是峰面积，X是西瑞香素质量浓度，单位为μg·mL-1。

3.38种大孔树脂静态实验的结果与分析 根据实验结果分析，大孔树脂HPD600的吸附率与解吸率在这些树脂中最佳，所以选择大孔树脂HPD600进行下一步动态纯化实验。结果见表1。

表18种大孔树脂对西瑞香素吸附率和解吸率

Tab.1Adsorptionrateanddesorptionrateofeightmacroporousresinsfordephnoretin

树脂种类树脂类型吸附率解吸率%D101非极性44.445.5HP20非极性44.946.0HPD450弱极性44.049.2NKA-9极性43.246.6HPD600极性48.750.6D4020非极性46.845.2DM130弱极性44.322.3AB-8弱极性37.344.6

3.4大孔树脂HPD600对了哥王中西瑞香素纯化工艺的吸附优化

3.4.1上样质量浓度的考察 以“2.5.1”项测得西瑞香素的峰面积代入回归方程计算西瑞香素质量浓度，并计算该大孔树脂的吸附率，结果吸附率分别为70.4%，79.6%，89.8%，96.3%，96.7%，见图2。

图2 上样浓度对树脂吸附效果的影响

Fig.2Impactofdifferentinitialconcentrateiononadsorptioneffectofresin

实验结果表明，当浓度>86.4 μg·mL-1时吸附率基本没有变化，由于浓度过高吸收杂质过多，杂质会覆盖在大孔树脂表面，会影响纯化效果；浓度过低不利于吸附，吸附率低，因此上样浓度约90 μg·mL-1，可为工业生产提供参考。

3.4.2上样体积流速的考察 以“2.5.2”项测得西瑞香素的峰面积代入回归方程式计算西瑞香素的质量浓度，并计算相应吸附率，结果吸附率分别为97.0%，97.2%，96.4%，95.8%，93.7%，见图3。

图3 不同吸附流速对树脂吸附效果的影响

Fig.3Impactofdifferentadsorptionvelocityontheadsorptioneffectofresin

实验结果表明，随着上样溶液流速逐渐增大，大孔树脂HPD600对了哥王中西瑞香素的动态吸附率逐渐下降，由于上样溶液的流速越小，与大孔树脂接触面积越大，大孔树脂表面的吸附效果越好，流速加快，泄漏量也跟着加大，从而影响吸附效果。在上样溶液流速分别为0.5，1.0和1.5 mL·min-1时，大孔树脂对样液中西瑞香素的吸附率相差不大，但过柱速率却相差1倍，所以通过综合考虑过柱速率与吸附率，选择上样样液流速为1.5 mL·min-1。

3.4.3上样体积的考察 以“2.5.3”项测得西瑞香素的峰面积代入回归方程式计算每管(5 mL)西瑞香素的浓度，结果1～18号管西瑞香素的浓度分别为0.0，2.0，2.4，2.2，2.2，2.4，3.6，5.0，8.8，29.4，52.9，62.4，71.5，79.4，82.8，87.5，88.0，88.1 μg·mL-1。

实验结果表明，当流出液收集到第9 个5 mL 的时候，西瑞香素溶液开始大量泄漏，当西瑞香素浓度约为90 μg·mL-1、样品液为45 mL时，基本达到饱和，建议上样液体体积为45 mL。

当了哥王中西瑞香素浓度约为90 μg·mL-1，上样体积为45 mL，上样流速为1.5 mL·min-1时，大孔树脂HPD600对了哥王中西瑞香素吸附最好。

3.5大孔吸附树脂HPD600对了哥王中西瑞香素纯化工艺的解吸优化

3.5.1洗脱剂体积分数的考察 以“2.6.1”项测得西瑞香素的峰面积代入回归方程式计算每管西瑞香素的质量浓度。结果解吸率分别为23.3%，50.4%，80.4%，92.9%，97.7%，见图4。

图4 不同浓度乙醇的洗脱效果

Fig.4Elutioneffectofdifferentconcentrationofethanol

实验结果表明，随着乙醇浓度逐渐增大，解吸率也随着逐渐增大，当乙醇浓度达90%时，解吸了哥王中西瑞香素效果比较好，如果用无水乙醇进行洗脱，洗脱下来杂质随之增多，影响纯化效果。因此选用90%乙醇对了哥王中西瑞香素进行洗脱。

3.5.2洗脱剂体积流速的考察 以 “2.6.2”项测得西瑞香素的峰面积代入回归方程式计算西瑞香素的浓度。结果解吸率分别为57.5%，58.1%，50.3%，47.2%，39.6%，见图5。

图5 不同解析流速对洗脱效果的影响

Fig.5Impactofdifferentdesorptionvelocityondesorptioneffect

实验结果表明，90%乙醇体积流速越快，解吸率越低。上样样液流速分别为0.5和1.5 mL·min-1时，大孔树脂对样液中西瑞香素的解吸率相差不大，但通过柱速率却相差1倍，通过综合考虑过柱速率与解吸率，因此选择1.5 mL·min-1为洗脱剂体积流速。

3.5.3洗脱剂用量的考察 以 “2.6.3”项测得西瑞香素的峰面积代入回归方程式计算出每管(5 mL)西瑞香素的质量浓度，当测到浓度接近于零时，停止。1～12号管中西瑞香素的浓度分别为0.0，259.7，192.8，140.6，78.4，41.5，13.6，10.7，7.0，4.6，4.3，4.1 μg·mL-1。

实验结果表明：当第6管以后，洗脱液中西瑞香素含量很少，所以应加90%乙醇洗脱剂体积为30 mL。

当洗脱了哥王中西瑞香素时，90%乙醇为洗脱剂，洗脱体积为30 mL，洗脱流速为1.5 mL·min-1时，对吸附后了哥王中西瑞香素的大孔树脂HPD600解吸最好。

3.6验证实验 按吸附最佳条件即：西瑞香素浓度约为90 μg·mL-1，上样体积为45 mL，上样流速为1.5 mL·min-1时重复实验5次，以“2.7.1”项测得西瑞香素的峰面积代入回归方程式计算西瑞香素的质量浓度，并计算大孔树脂HPD600的吸附率，结果吸附率分别为97.7%，96.2%，97.0%，97.2%，97.0%；按解吸最佳条件即：90%乙醇为洗脱剂，洗脱体积为30 mL，洗脱流速为1.5 mL·min-1进行洗脱，以“2.7.2”项测得西瑞香素的峰面积代入回归方程式计算出西瑞香素的质量浓度，并计算大孔树脂HPD600的解吸率，结果解吸率为98.0%，91.7%，98.1%，97.3%，97.3%，富集西瑞香素回收率为95.7%，88.2%，95.1%，94.5%，94.3%。纯化后西瑞香素纯度由29%提高到53%。

4 讨论

通过实验可知，大孔树脂HPD600对了哥王中西瑞香素具有良好的吸附和解吸性能，了哥王样品原液中的西瑞香素大部分被树脂吸附，而且解吸的效果也很好。说明大孔吸附树脂HPD600是分离纯化了哥王中西瑞香素的优良材料。

本实验结果表明，HPD600纯化了哥王中西瑞香素较佳吸附条件为上样浓度约为90 μg ·mL-1，上样液体体积为45 mL，上样速度为1.5 mL·min-1，吸附率达97.5%；较佳的洗脱条件为乙醇浓度90%，洗脱剂体积为30 mL，洗脱速度1.5 mL·min-1，解吸率为96.4%，富集西瑞香素回收率93.6%，西瑞香素含量明显升高，说明该纯化工艺效果良好。该实验结果为了哥王中西瑞香素的工业化纯化提供了理论参考。