当归-川牛膝水煎剂对自发性高血压大鼠血清ET-1、NO表达的影响＊

王 莉，谢 青，毛玉娟，杨 锐，江 华，何亚丽，申进增，伊 琳＊＊

（1.甘肃中医药大学中西医结合学院 兰州730000；2.秦安县人民医院 秦安741600）

原发性高血压是全球最常见最危险的慢性疾病之一，其危害不仅是血压升高给患者带来的生活影响，同时会引发一系列并发症，如高血压所致的脑卒中，其发病率和致死率均较高；高血压更成为心血管疾病的主要危险因素，可造成多处靶器官的损伤，甚至引发脏器功能衰竭，严重影响人们的健康状况以及生活水平。据统计，全球高血压患者占全球总人口的26%[1]，近年来有增长的趋势，发病年龄也逐渐趋于年轻化。调查显示，超过80%的高血压患者以服用单纯西药降压药为主，虽能抑制血压的升高，但对于各类并发症并没有针对性的管理和治疗，疗效具有较大的局限性。相比之下，中医药以天然中药材为原料，具有安全降压，副作用小，从整体水平调节人体代谢系统的优势，在改善患者依从性和提高患者生活质量方面更具有独特优势，从而在新药的研发中占据有利地位[2,3]。

当归和川牛膝均具有活血化瘀之功效，为中医治疗高血压的常用中药材，并常被研究人员进行单味中药的药理、成分研究，二者提取物中皆含有大量降压成分，二者的提取物和水煎液均可使自发性高血压大鼠（SHR）的血压降低。本课题组之前也针对当归挥发油通过改善SHR脂代谢从而降压的分子机制进行了研究[4,5]。然而，目前还没有涉及当归-川牛膝水煎液合剂的降压疗效以及药理、成分的研究。因此，本研究以SHR为研究对象，对比了当归-川牛膝水煎剂的不同提取成分对SHR血压以及动脉血清中内皮素（ET-1）、一氧化氮（NO）的表达的影响，对当归-川牛膝水煎剂降压的机制进行了初步探索，为进一步研究当归-川牛膝降压的有效成分及分子靶标奠定了基础，同时也为当归-川牛膝降压的现代中药指南制定提供了一定的借鉴依据。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级6周龄雄性SHR大鼠48只，体重（200±20）g，购自北京维通利华实验动物公司，动物合格证号：SCXK（京）2016-0006；SPF级6周龄雄性Wistar大鼠6只，体重（200±20）g，购自甘肃中医药大学动物实验中心，动物合格证号：SCXK（甘）2013-0002。饲养于甘肃中医药大学SPF级动物实验中心，环境温度（23.0±2.0）℃，相对湿度（35±5）%，换气量10-20次·h-1，日光灯采光，明暗交替，常规充足饲料喂养，自由饮水，环境安静。

1.2 实验仪器

SY-2000旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），DZKW型电子恒温水浴锅（北京永光明医疗仪器厂），马头牌JYT-20A架盘药物天平（上海医用激光仪器厂），电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司），DZF-6020MBE真空干燥箱（上海一恒科学仪器厂），Biofuge stratos高速冷冻离心机（美国科峻仪器公司），XH200型恒温式无创血压测量仪（上海玉研科学仪器有限公司）。

1.3 药品及试剂

当归和川牛膝饮片均购自甘肃省兰州市西固区陈坪街道福利东路社区卫生服务站，经甘肃中医药大学药学院赵磊教授鉴定分别为伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根和苋科植物川牛膝Cyathula officimlisKuan的干燥根；缬沙坦胶囊（国药准字：H20040217），购自甘肃中医药大学附属医院。

D-101型大孔吸附树脂（沧州宝恩吸附材料科技有限公司），无水乙醇（分析纯）（天津市永大化学试剂有限公司），制备当归-川牛膝水煎剂分离物用；氢氧化钠、浓盐酸（天津大茂化学试剂厂），预处理大孔吸附树脂用。

大鼠一氧化氮（NO）ELISA试剂盒（批号：MM-20607R1），大鼠内皮素-1（ET-1）ELISA试剂盒（MM-0560R1），江苏菲亚生物科技有限公司。

2 方法

2.1 药物及配制

取等量当归和川牛膝饮片，依据《中国药典》（2010版）当归常用量6-12 g，川牛膝常用量5-10 g，确定当归-川牛膝用量为10 g:10 g，根据人和大鼠用药剂量换算公式（参考徐叔云教授主编的《药理实验方法学》中人和动物间按体表面积折算的等效剂量比值），大鼠用药剂量=人临床用药剂量/体重（kg）×6.3，故大鼠当归-川牛膝用量为2.1 g·kg-1。按上述比例取生药600 g，加水浸泡后煎煮2次，合并煎液，滤过，取1/2药液浓缩干燥制成药物干粉备用，以便后续配制原液；剩余1/2药液浓缩再离心取上清液后经大孔树脂吸附，然后依次用水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇及90%乙醇洗脱，洗脱液减压浓缩回收乙醇，获取不同的分离物。相当于生药材300 g的当归-川牛膝水煎液经干燥后最终得177.9084 g药物干粉，得出率59.30%。相同质量的水煎液经大孔吸附树脂纯化分离，各分离组经干燥最终所得药物干粉分别为：水洗组121.0325 g、30%醇洗组4.5001 g、50%醇洗组1.0733 g、70%醇洗组0.9866 g、90%醇洗组0.0843 g，得出率分别为40.34%、1.50%、0.36%、0.33%、0.03%。30%乙醇洗脱组占总醇洗组分的比例最高，占总醇洗组分的67.73%，占总干粉质量的2.53%。当归-川牛膝水煎液经大孔吸附树脂纯化分离，各分离组所得药物量与生药是等效的，由此得出各分离组的大鼠用药量依次为：①水洗组SHR用量：2.1×40.34%≈0.8471 g·kg-1；②30%醇洗组SHR用量：2.1×1.50%≈0.0315 g·kg-1；③50%醇洗组SHR用量：2.1×0.36%≈0.0076 g·kg-1；④70%醇洗组SHR用量：2.1×0.33%≈0.0069 g·kg-1；⑤90%醇洗组SHR用量：2.1×0.03%≈0.0006 g·kg-1。水煎液组的SHR用量为2.1×59.30%≈1.2453 g·kg-1。取缬沙坦胶囊粉末用生理盐水配制成混悬液备用，根据人和大鼠用药剂量换算公式，计算出缬沙坦用药量为8.4 mg·kg-1，按照1 mL/100 g的灌胃剂量，配制成0.84 mg·mL-1的混悬液。

2.2 动物分组及给药方法

48只SHR大鼠随机分为8组：即模型对照组、缬沙坦组、当归-川牛膝组和分离组（水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇及90%乙醇），相配对的WKY大鼠为正常对照组，适应性喂养1周后给药。按照大鼠常规给药剂量，依据大鼠体重，给药量为1 mL/100 g。模型对照组和正常对照组给予生理盐水，不给任何药物；缬沙坦组给配制好的缬沙坦混悬液，各分离组给对应的药物分离物，每天定时给药，每周给药7 d，连续给药4周，随体重变化调整给药剂量。

2.3 血压测定及质量控制

采用尾动脉容积无创血压测量法测量清醒下的SHR血压。将鼠尾与XH200型恒温式无创血压测量仪及MedLab MP1000生物信号采集处理系统的脉搏传感器紧密相连，测定安静、清醒状态下的鼠尾动脉收缩压，用药前及用药后每周均测血压一次。实验开始后，分别于给药前、给药1周、给药2周、给药3周、给药4周测量大鼠血压5次。测压过程宜轻柔，避免激惹大鼠，造成血压波动；鼠笼尺寸应适合大鼠体型大小，避免大鼠在内挣扎，影响数据准确性；加温时间不宜过长，保持室温稳定，保证环境安静[3]。

2.4 指标检测

末次给药后24 h，禁食不禁水12 h后，用3%戊巴比妥钠（30 mg·kg-1）腹腔注射麻醉大鼠，采用腹主动脉采血法，取血8 mL，静置后放入Biofuge stratos高速冷冻离心机，3500 r·min-1离心10 min，取出吸取上清液（即血清），分装于2 mL EP管中，放于-20℃冰箱备用。采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定内皮素（ET-1）和一氧化氮（NO）水平。

2.5 数据处理

3 结果

3.1 当归-川牛膝水煎剂对SHR大鼠血压的影响

治疗前模型组、缬沙坦组、当归-川牛膝组、各分离组较正常对照组血压明显偏高，差异均有统计学意义（P<0.05）（表1）。

治疗1周缬沙坦组、当归-川牛膝组、各分离组和正常对照组比较，均有显著差异，差异具有统计学意义（P<0.05）。治疗2周缬沙坦组、当归-川牛膝组、各分离组和正常对照组比较，均有显著差异，差异具有统计学意义（P<0.05）。治疗3周缬沙坦组、当归-川牛膝组、各分离组和正常对照组比较，均有显著差异，差异具有统计学意义（P<0.05）。治疗4周缬沙坦组和正常对照组比较无显著差异（P>0.05），当归-川牛膝组、各分离组和正常对照组比较均有显著差异，差异具有统计学意义（P<0.05）（表1）。

治疗4周，缬沙坦组、当归-川牛膝组、各分离组和模型组比较，均有显著差异，差异具有统计学意义（P<0.05），缬沙坦组和正常对照组比较，无显著差异（P>0.05），当归-川牛膝组、30%醇洗组和缬沙坦组比较，无显著差异（P>0.05），水洗组、50%醇洗组、70%醇洗组、90%醇洗组和缬沙坦组比较，均有显著差异，差异具有统计学意义（P<0.05）（表1）。

表1 各组大鼠血压比较（±s，mmHg）（n=6）

表1 各组大鼠血压比较（±s，mmHg）（n=6）

注：a.与正常对照组比较，P<0.05；b.各治疗组与正常对照组比较，P<0.05；c.治疗4周缬沙坦组、当归-川牛膝组、各分离组和模型组比较，P<0.05；d1.治疗4周缬沙坦组和正常对照组比较，P>0.05；d2.治疗4周当归-川牛膝组、30%醇洗组和缬沙坦组比较，P>0.05；d3.治疗4周水洗组、50%醇洗组、70%醇洗组、90%醇洗组和缬沙坦组比较，P<0.05。

组别正常对照组模型组缬沙坦组当归-川牛膝组水洗组30%醇洗组50%醇洗组70%醇洗组90%醇洗组治疗前110.78±5.58 164.75±6.93a 163.37±6.96a 167.38±6.90a 162.79±6.35a 166.63±6.14a 164.38±6.08a 163.47±7.91a 165.62±5.76a治疗1周111.72±6.02 164.12±8.41 149.07±6.62b 157.42±7.08b 157.45±6.49b 159.84±5.87b 160.24±6.04b 159.61±5.81b 160.49±5.82b治疗2周109.52±5.99 163.37±7.67 139.68±6.22b 149.94±5.76b 150.72±6.07b 150.64±6.11b 153.35±6.57b 150.44±7.45b 153.62±6.25b治疗3周108.92±5.01 165.78±6.79 130.28±7.15b 137.89±6.49b 143.65±5.97b 140.56±6.41b 142.85±7.10b 145.68±8.21b 146.76±5.97b治疗4周108.86±5.89 168.16±5.91 116.09±6.56cd1 123.94±7.78bcd2 137.78±7.69bcd3 124.05±5.83bcd2 132.85±5.13bcd3 139.57±8.25bcd3 143.58±4.72bcd3

3.2 当归-川牛膝水煎剂对SHR大鼠血清中ET-1和NO表达的影响

模型组ET-1水平明显高于正常对照组，NO水平明显低于正常对照组，差异均具有统计学意义（P<0.05）；缬沙坦组、当归-川牛膝组、30%醇洗组ET-1水平明显低于模型组，NO水平明显高于模型组，差异均具有统计学意义（P<0.05）（表2）。

表2 各组大鼠血液中ET-I、NO水平比较（n=6）

4 讨论

中医学无高血压病名，属“眩晕”、“头痛”范畴，需根据证型来确定诊疗方法，其病机主要分为肝阳上亢、肝肾阴虚、阴虚阳亢、阴阳两虚等。相关理论认为该病的病理产物以“痰饮”和“瘀血”为主，会导致经脉气血阻滞不通，血液、津液的运行不畅，停留在脉道内势必引起血液压力的升高，形成高血压疾病。笔者认为，当归为常用的活血祛瘀药，配合川牛膝的利水消肿之功，可以“去旧生新”，祛除血液、津液系统中的瘀阻，使人体气机畅行，上下通调以使血压恢复正常。两味中药的功用相辅相成，共同作用于血液和津液两个系统，全面调节人体的气血津液平衡，从根本出发降低血压。

中药当归为伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根，据文献统计，当归为治疗高血压使用率最高的中药材之一[6]。现代研究表明[7]，当归提取物通过对RASS系统、离子通道、血管神经等方面对高血压的发生发展产生一定的影响；其提取物降压效果显著，对微循环的加快、血黏度的降低、利尿、血脂的调节和免疫等方面都起到良好的作用[5,8]。当归药效成分研究显示，其提取物中主要起降压作用的成分为鞣酸、腺苷、牛磺酸和阿魏酸等。当归中阿魏酸能使小鼠心肌营养血流量增加，并稳定缺氧心肌细胞膜，较大程度减轻细胞损伤[9]；含量仅为1%的挥发油成分藁本内酯，可通过抑制ROCC和VOCC介导的主动脉平滑肌收缩实现降压的效果；此外，5-羟甲基糠醛被发现与鞣酸、腺苷等成分共同作用，通过阻滞钙离子通道、兴奋中枢β、M受体、扩张小血管、降低肾素-血管紧张素活性等过程完成降压的作用。

川牛膝为苋科植物川牛膝Cyathula officimlisKuan的干燥根，功善逐瘀通经，也常用其与其他药材配伍以降低血压。现代药理研究证实，单味川牛膝也有一定的降血压作用，其水煎液主要通过改善血管重构，抗炎抗氧化应激以及保护靶器官，改善心肌纤维化三个方面达到降低自发性高血压大鼠（SHR）血压的效果[3,10-12]。已有文献报道[13]，氧自由基（OFR）在心血管疾病的发生发展中具有重要的促进作用，氧自由基可参与高血压的形成、发展及其产生并发症的全过程。实验研究也表明[14]，川牛膝可通过上调体内重要的抗氧化酶SOD来降低氧自由基含量，从而达到降低血压的目的。

现代研究表明，肾素血管紧张素-醛固酮系统（RAS）的激活是高血压发病的重要体液机制，血管紧张素原在肾素的作用下，水解而成的主要效应物质血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）作用于AngⅡ受体，促进血管收缩和肾上腺皮质分泌醛固酮，引起血压增高[4]。此外，AngⅡ不仅能收缩小动脉血管，并可通过炎症反应和氧化应激诱导高血压的发生。高血压的治疗可着眼于阻断肾素血管紧张素-醛固酮系统中的环节，如抑制AngⅡ的生成。目前对于高血压的治疗多将重点放在对ACEI的抑制，ACEI可抑制血管紧张素转换酶的表达，阻碍AngI转换为AngⅡ，促进血管舒张。当归能剂量性降低血清中肾素和AngⅡ的表达水平，并在改善心肌组织结构，抑制心肌肥大具有良好疗效[15]。王艳[16]等实验结果表明，川牛膝具有抑制血管紧张素转换酶表达的作用，从而阻断AngⅡ生成，使血管舒张，进而血压下降。

ET-1是目前发现作用最强的血管收缩肽和血流调节因子，ET-1的过表达引起的血管收缩、心肌缺血、代谢紊乱和细胞增殖是与血管损伤有关疾病的重要致病因素。NO是肺循环的血管扩张剂，能松弛血管平滑肌张力，在降低肺动脉阻力和维持肺血管扩张方面起着关键作用[17]。研究表明，原发性高血压患者血浆NO浓度降低[18]，高血压患者内皮依赖性血管舒张功能受损[19]。研究已证实，吸入NO可减轻肺血管收缩[20]，并可提高肺动脉高压大鼠模型的存活率[21]。高血压的病机本质是动脉血管的病变，血压升高导致血管内皮功能障碍，内皮细胞产生和释放的舒血管活性物质和缩血管活性物质失去原有的平衡，则会进一步加重高血压。ET-1和NO是血管内皮功能的重要指标，是一对非常重要的血管舒缩物质，高血压患者的血管内皮细胞中ET-1表达增加，NO表达减少。因此，检测血清中ET-1和NO的表达量可以简单而有效地评估SHR的血压变化情况。

本研究结果表示，缬沙坦、当归-川牛膝水煎剂及其30%醇洗组均能有效降低SHR的血压，并能降低ET-1的表达，升高NO的表达，表明当归-川牛膝水煎剂及其提取物具有显著地降压作用，其变化趋势和ET-1及NO的变化趋势基本吻合，提示当归-川牛膝水煎剂及其提取物可能是通过调节血管内皮细胞以及血液中ET-1和NO的平衡而实现降压效果。

依据治疗前后的血压变化表，可以看出，治疗1周后缬沙坦组的血压下降程度较中药组大，但治疗2周、3周、4周的降压效果有所减弱；而各中药治疗组每周的血压变化基本相同，呈匀速降低趋势。因此，我们认为西药降压见效虽快，但其疗效不稳定；中药降压较为缓慢，却能保持一定的速率平稳发展。由此可见，中药降压仍具有其独特的优势。

比较当归-川牛膝各分离组的降压疗效可以看出，以30%乙醇洗脱组为最佳，和当归-川牛膝全药组相当，效果优于水洗组及高浓度醇洗组；对比模型组，各治疗组在改善ET-1及NO这一对血管活性物质方面，全药组、30%醇洗组与缬沙坦组均具有显著的效果，而其余治疗组并无显著差异。说明当归-川牛膝在30%的乙醇溶液中能最大程度析出有效成分，可以包含原药的绝大部分活性成分。后续我们可以针对当归-川牛膝水煎液的30%醇洗组的成分进行检测，以具体研究其降压的活性物质及作用靶标。

当归和川牛膝作为单药均被证实具有显著地降压效果，并对其作用机制的研究也比较多，但是，二者均具有活血化瘀通经之功效，针对当归-川牛膝合剂的降压疗效的研究尚属少见，对其降压的有效成分的报道也比较少。本研究仅对当归-川牛膝水煎液降血压的疗效以及其对血管活性物质的影响进行检测，主要对比了不同提取方式其活性成分的降压效果。然而，二者的降压成分是否具有相似性，在药效方面是否具有相互促进的作用？今后针对当归-川牛膝降血压的研究也可以围绕这两个方向展开。