基于分子对接和系统药理学探讨人参汤治疗冠心病的作用机制＊

徐香梅，徐文华，杨文娜，陈 旋，赵 阳，赵新望，郑景辉

（1.广西中医药大学 南宁530001；2.广西中医药大学附属瑞康医院 南宁530001）

冠心病是一种慢性血管性疾病，近年来，人们对冠心病的相关研究日益重视。根据2017年中国心血管指南数据报告推算冠心病现患人数1100万，患病率持续升高，并为心血管病最大危险因素之一[1]。人参汤出自张仲景的《金匮要略》，文中记载：“胸痹心中痞，留气结在胸，胸满，胁下逆抢心，枳实薤白桂枝汤主之，人参汤亦主之。”随着现代药理学研究不断发展,人参汤广泛用于治疗多种心脏疾病，并均有明显的疗效。本研究利用分子对接和系统药理学方法，探究人参汤治疗冠心病的作用机制，该方法有并综合网络分析“药物-靶点-疾病-信号通路”方面。从而整体系统的来分析人参汤中复杂的网状协同作用治疗冠心病的原理，此方法为中药潜在活性成分对治疗疾病的作用靶点预测及作用机制的阐述的研究提供新思路[2]。

1 材料与方法

1.1 人参汤的活性化合物的筛选

本研究借助中药系统药理学和分析平台TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）,以OB≥30%，DL≥0.18筛选人参汤中“干姜”、“白术”、“人参”、“甘草”的有效化合物活性成分。

1.2 人参汤化合物相对应靶点的收集

将TCMSP中筛选出来的有效化合物通过DrugBank数据库（https://www.drugbank.ca/）确认出人参汤每个化合物的有效作用靶点。

1.3 人参汤化合物-靶点的网络构建

对同一化合物预测产生的相同靶点进行筛选剔除，录入UniProt（https://www.uniprot.org/）数据库中检索，选择物种为“Homo sapiens”，剔除重复、非人源与不规范的靶点，经检索和转化操作最终得到人参汤活性成分的基因靶点（Gene symbol），再将将筛选出来的人参汤化合物和相关靶点导入Cytoscape3.7.0软件中，构建化合物-靶点网络。

1.4 冠心病相关靶点的获取

利用在线文本挖掘服务器GeneCards（https://www.genecards.org/）收集与冠心病相关的靶点。数据库以关键词“Coronary heart disease（CHD）”进行搜索，通过Gifts算法计算靶点与冠心病的相关度，并按照相关度的排序选择得分≥30的靶点作为冠心病靶点进行研究，并摘录相应的靶点的标准基因名。

1.5 人参汤对冠心病的作用靶点蛋白互作网络

通过利用Venn在线分析工具获得人参汤和冠心病共同交集的靶点来确认为人参汤治疗冠心病的作用靶点。再把作用靶点收集在一起后上传至在线STRING10.5（http://string-db.org）获取基因靶点。再运用Cytoscape3.7.0软件对其构建蛋白互作网络图。

1.6 人参汤基因本体（GO）功能富集分析

通过采用Davidv6.8.0数据库对人参汤作用于冠心病的靶点蛋白进行GO功能富集分析。包括生物过程（BP，biological process），细胞组分（CC，cellular component），分子功能（MF，molecular function）。将人参汤作用于冠心病的靶点GO功能富集结果进行可视化分析。

1.7 人参汤KEGG通路富集分析

利用DAVID平台的KEGG富集分析功能,对人参汤作用于冠心病的靶点中涉及的18个蛋白质的功能进行了研究，富集出23条信号通路，并导入omicshare（http://www.omicshare.com/）进行可视化处理。

1.8 人参汤中主要活性成分−人参汤对冠心病作用靶点分子对接结果分析

依据网络拓扑学参数，选出人参汤关键的化合物和靶点。登陆系统分子对接Systems Dock Web Site（Systemsdock）数据库，将人参汤治疗冠心病的潜在18个作用靶点输入PDB ID，找活性位点，计算格点，调整X-Y-Z坐标来细化位置。在系统对接中应用AutoDockVina进行对接模拟，预测蛋白质和配体结合的性能，调整X-Y-Z坐标和网格大小以细化绑定的位置[3]。对接结果的分数=的负对数，Docking Scores的值通常为0至10。输入筛选后的人参汤化合物的结构，成功后开始对接,整理对接结果中的Docking Score并分析。

2 结果

2.1 人参汤活性化合物的筛选

通过TCMSP软件以药物标准OB≥30%和DL≥0.18为条件筛选出人参汤活性化合物共126个，其中干姜5个，人参22个，甘草92个，白术7个。这126个化合物包括：西拉苯嗪（Celabenzine）、甘草醇（Glycyrol）、7,2'，4'-三羟基-5-甲氧基-3-芳基香豆素（7,2',4'-trihydroxy-5-methoxy-3-arylcoumarin）、苦参素（licopyranocoumarin）、利可霉素（liquiritin）、葛根素B（GlepidotinB）、甘草利酮（Licoricone）等。各个化合物的OB和DL值见表1。

2.2 人参汤化合物-靶点相互作用网络

为了更直观地表示化合物分子和靶点之间的相互作用关系，构建了化合物-靶点网络，共有38个化合物节点和94个靶点节点,126个化合物中有88个未参与网络构建。取每一个化学成分的前20个蛋白，再将这些蛋白导入STRING数据库中，剔除掉非人源蛋白和重复蛋白，最后整合共得到84个靶点。将得到的结果导入Cytoscape软件中构建“化合物成分-作用靶点”网络图（图1）。

2.3 人参汤对冠心病的作用靶点

根据Gene-Cards数据库（https://www.GeneCards.org/）分析按照相关度排序选择得分≥析按收集冠心病靶点219个[4]。利用Venn分析工具，将人参汤化学成分靶点与冠心病相关发病机制靶标进行对比分析，得出人参汤化学成分靶点与冠心病相关发病机制的18个靶点基因，分别为SCN5A、NOS2、TNF、IL1B、NR3C2、SELE、ADRB1、MMP1、HTR2A、VCAM1、PPARG、ADRB2、F7、IFNG、HMOX1、PON1、KCNH2、ESR1。

2.4 人参汤对冠心病的作用靶点蛋白互作网络

为了更直观地观察人参汤对冠心病作用的潜在靶点之间的关系，将人参汤化学成分靶点与冠心病相关发病机制的18个潜在靶点导入Cytoscape软件中构建PPI网络（图3）。如图所示，人参汤对冠心病作用的潜在靶蛋白PPI网络有16个节点（2个靶蛋白未参与蛋白的相互作用），分别为心脏钠离子通道α亚单位（SCN5A），一氧化氮合酶（NOS2），肿瘤坏死因子（TNF），重组白细胞介素1（IL1B），选择素E（SELE），β1肾上腺素受体（ADRB1），基质金属蛋白酶（MMP1），重组人血管细胞粘附分子-1（VCAM1），过氧化物酶体增殖因子活化受体γ（PPARG），β2肾上腺素能受体（RB2），类黄酮7（F7），姜黄素抑制（IFNG），血红素加氧酶1（HMOX1），对氧磷酶（PON1），离子通道基因（KCNH2），雌激素受体（ESR1）。

表1 人参汤的活性化合物基本信息

2.5 人参汤对冠心病作用靶点GO功能富集注释分析

为了研究人参汤中作用靶点具备的基因功能，借助DAVID数据库进行GO功能富集分析，得出109个GO条目，其中生物过程相关的条目最多，共有85条生物过程（BP），主要包括趋化因子生物合成过程的正向调控，一氧化氮生物合成工艺的正反馈，基因表达负调控，胰岛素分泌调节，膜蛋白外域蛋白水解阳性调节，基因表达负调控，类固醇激素介导的信号通路，白介素6生物合成过程的阳性调节，杀伤其他生物细胞的阳性调节等方面;其中有10条细胞组分（CC），主要包括质膜，肌纤维膜，细胞质的核周区域，等离子体膜，细胞外空间等组成部分。并有14条分子功能（MF），主要包括肾上腺素，去甲肾上腺素，酶结合，蛋白质同源二聚化的激活和类固醇激素受体活性等方面。将人参汤PPI网络的GO功能富集蛋白通过GraphPad软件做出BP，CC，MF柱状图，具体GO分析注释见图4。

图1 人参汤化合物-靶点网络

图2 人参汤-冠心病共同靶点图

图3 人参汤对冠心病作用靶点的蛋白互作网络

2.6 人参汤对冠心病作用靶点KEGG通路富集分析和气泡图

为了明确人参汤作用靶点在信号通路中的作用，通过DAVID数据库来进行KEGG通路富集分析功能，分析结果显示人参汤作用于冠心病的通路有23条，其中 包 括NF-κB信 号 通 路（NF-kappa B signaling pathway），肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway），钙信号传导途径（Calcium signaling pathway），心肌细胞中的肾上腺素能信号传导（Adrenergic signaling in cardiomyocytes），HIF-1信号通路（HIF-1 signaling pathway），非洲锥虫病（African trypanosomiasis），疟疾（Malaria），阿米巴病（Amoebiasis），I型糖尿病（Type I diabetes mellitus）等。将KEGG通路富集的通路有23条导入omicshare平台做出高级气泡图，具体分析见图5。

2.7 人参汤对冠心病作用靶点KEGG通路富集通路图

通路富集分析KEGG分析发现人参汤作用于冠心病的靶点的通路有23条，其中按FDR<0.05选取有19条信号通路富集最相关（表2）。点击相关性较大的NF-κB信号通路Chart（图6）。

2.8 人参汤中主要活性成分−人参汤对冠心病作用靶点分子对接结果分析

根据拓扑学参数PTGS2、ESR1、AR、PTGS1、NCOA2为计算中最重要的五个靶点，分别是MOL005384（Suchilactone苏齐内酯）、MOL000358（beta-sitosterol谷固醇；甾醇,植物甾醇）、MOL000422（kaempferol山柰酚；堪非醇）、MOL000787（fumarine原阿片碱；延胡索碱）、MOL000449（stigmasterol豆固醇；豆甾醇；豆甾烯醇）为计算中最重要的五个化合物分子对接结果。分子对接结果分析见表3。分子对接结果显示人参汤多个靶点的Docking Score值大于8.0证明有强烈的结合活性（图7）。由此表明人参汤与人参汤对冠心病作用靶点有较好的结合活性。

图4 人参汤对冠心病作用靶点的GO功能富集BP、CC、MF分析柱状图

3 讨论

冠心病是一种慢性血管性疾病，其发病机制复杂，涉及脂质代谢，血流动力学，细胞凋亡以及一系列炎症反应等各个方面。常年处于较高的发病率和死亡率，探索一种安全有效的科学治疗方法迫在眉睫。近年来，冠心病的诊断与治疗有了长足的进步，但其病因学与发病机理的研究仍进展缓慢。本研究采用综合网络“药物-靶点-疾病-信号通路”等分析，从整体系统的分析人参汤干预冠心病的潜在作用靶点的作用机制，为预防及治疗冠心病提供科学依据，对于阐述其治病的科学性具有重要意义。

本研究在检索人参汤4味中药的化学成分和作用靶点后，构建化合物-靶点网络的过程中发现人参汤中可能潜在的关键化合物包括PTGS2，PTGS1，ADRB2等。PTGS1和PTGS2同源于PTGS，属于它的2种异构酶，也是起重要作用的限速酶，PTGS广泛参与机体的肿瘤新生、炎症反应、凝血平衡等病理过程[5]。由此可知，PTGS极大可能参与了机体发病机制过程。ADRB2是β1肾上腺素能受体，主要存在血管平滑肌细胞和肾脏的多种细胞中，参与交感神经系统调控机体的一部分。郭威早[6]等认为β2肾上腺素能受体在心肌细胞中和糖皮质激素受体具有明显的关联性，该受体可通过调节肾脏Na＋、血管紧张肽原酶、肾素来调节血压，从而影响心肌细胞炎症反应机制。罗亨全[7]等认为ADRB2其基因位于第5号染色体，介导儿茶酚胺递质产生生理学效应。由此可推断，ADRB2受体通过改变血管紧张性和儿茶酚胺等多种途径参与了冠心病的发病过程。

图5 人参汤对冠心病作用靶点KEGG通路富集分析气泡图

面对冠心病的发病机制是存在复杂性,本研究在此方面进行了更深入的研究，为了明确人参汤作用靶点在信号通路中的作用，结合系统药理学的系统分子对接中找出关键人参汤的关键化合物和靶点。预测其蛋白质和配体结合的性能，分子对接结果显人参汤多个靶点的Docking Score值大于8.0证明有强烈的结合活性由此表明人参汤对冠心病作用靶点有非常强的结合活性。并通过进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析功能，GO分析结果发现生物过程相关的条目最多，有85条生物过程，主要包括趋化因子生物合成过程的正向调控，一氧化氮生物合成工艺的正反馈，基因表达负调控，胰岛素分泌调节，膜蛋白外域蛋白水解阳性调节，类固醇激素介导的信号通路，白介素6生物合成过程的阳性调节等方面。其次发现14条分子功能主要在肾上腺素，去甲肾上腺素，酶结合，蛋白质同源二聚化的激活和类固醇激素受体活性等方面发挥作用。另外有10条细胞组分，主要包括对质膜，肌纤维膜，细胞质的核周区域，等离子体膜，细胞外空间等组成部分参与了其中。由此本研究可得出,人参汤对治疗冠心病的作用靶点与这三个方面的参与调控和改变密切相关。在进行（KEGG）通路富集分析出来的23条信号通路中发现NF-κB信号通路相关性较大，NF-κB作为信号传导途径中的重要枢纽，在心血管复杂的生理病理过程中起着重大影响。阐明其病理机制和NF-κB两者的相互关系有利于防治心血管疾病。

表2 人参汤作用于冠心病的蛋白的富集通路表

图6 人参汤中NF-κB信号通路潜在靶基因的KEGG通路分析

表3 人参汤中主要活性成分−人参汤对冠心病作用靶点分子对接结果

图7 人参汤对冠心病作用靶点分子对接的结合活性

本研究发现炎症相关的信号通路主要富集在NF-κB信号通路，通过调节NF-κB及相关因子，减少TNF-α、IL-1β、NO等炎症因子的释放，阻碍其致炎作用。核因子κ因作为一种起重大作用的转录因子，存在于血管内皮细胞和平滑肌细胞中，参与着机体的免疫应答，防御功能及炎症反应有关基因的表达调控[8]。国外文献有资料已证实，NF-κB可调节多种参与炎症、免疫、细胞增殖反应的细胞因子、粘附分子、炎症介质、蛋白酶的基因表达，从而影响生物合成[9]。最新研究发现，核因子κ因（NF-κB）基因被克隆30多年来，人们对它的研究日趋深入，已发现一系列受其调控的基因，这些靶基因产物在大量参与了细胞生存、增值和分化、调节细胞凋亡衰老等多个环节的心血管疾病病理过程[10]。NF-κB可通过调控促炎因子TNFα、IL-1α及COX-2和iNOS诱导酶等基因编码来参与炎症反应[11]。潘海燕[12]等认为NF-κB及AP-1对心肌组织中异位胰蛋白酶及促炎细胞因子的调控作用。陈涛[13]等研究表明，NF-κB调控致炎因子、粘附分子等多种细胞因子的表达，这些因子促进单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）转录激活，并进一步促进粥样硬化病灶的形成。因此可知，动脉粥样硬化病变主要是受趋化因子单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）的调控。NF-κB在动脉粥样硬化的发生发展中起着直接间接的作用。并已有国外文献研究表明，NF-κB在单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）扮演着转录激活的作用。肺炎链球菌感染刺激人内细胞MCP-1基因表达需要NF-κB信号通路的激活[14]。由此可发现，NF-κB参与血管炎性反应与动脉粥样硬化病灶发生发展密切有关。郝进[15]等发现活化补体成分诱导内皮细胞生成IL-8及MCP-1由NF-κB途径调控，进而促进缺血心肌的血管生成，Psel基因启动子促进Psel基因的表达，在2 h时能检测到这种增高。并定向归巢于缺血心肌，其作用与NF-κB介导的微血管内皮细胞引发的损伤后反馈有关。由此可见，人参汤主要通过影响血流动力学和组织代谢、细胞增殖、分裂，分化、凋亡和抵抗各种刺激的反应，如氧化应激、炎症、缺血等而发挥治疗冠心病的作用。

AP-1是肿瘤坏死因子受体，也是参与多种信号通路的关键受体。潘海燕[16]等认为AP-1参与调控多种炎症介质及细胞因子的表达。如李群益[17]等发现人参皂苷代谢产物通过抑制肿瘤坏死因子-α（TNF-α），从而诱导支气管上皮细胞分泌RANTES，此诱导机制跟抑制AP-1对下游靶基因的调控有关。TNF作为一种能够直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细胞因子，是目前所发现直接杀伤肿瘤作用最强的生物活性因子之一。可分为TNF-α，TNF-β两种，TNF家族除这两种外还发现约30种。在本研究中作为肿瘤坏死因子信号通路，具有明显的生物学功能，通过引发炎症从而致细胞生长分化和凋亡，并在血管内皮损伤过程中发挥重要的作用。TNF-的是一个强有力的炎症介质，体外循环前后出现不同程度的升高，可能与刺激激活了机体的炎症反应有关。体外循环过程中这种变化虽不是一种损害，是机体对损伤的一种生理反应过程[18]。而这一过程间接的引发了微血管内皮细胞的损伤，从而参与血管炎性反应与动脉粥样硬化病灶发生发展。

综上所述，人参汤现今临床上广泛用于多种心脏疾病，如心肌梗死、心衰及心律失常尤其是冠心病心绞痛，在改善心肌供血、抑制炎性反应、抗动脉粥样硬化、减少心肌氧耗等均有较好的疗效。本研究通过应用分子对接和系络药理学等方法，从整体性，系统性来分析人参汤多成分、多途径、多靶点协同作用在干预冠心病的作用原理，充分体现了中药复方在治疗疾病的整体性和综合性特点。在系统药理学的研究过程中，本研究结果只初步预测了人参汤相关药理学作用和相关机制。还尚未发现人参汤和冠心病存在明确的靶点对应关系，需进一步对其治疗疾病具体作用机制进行实验验证，利用高效液相和质谱分析的手段进一步分析其入血成分。更需要进行更深入的研究以明确人参汤治疗冠心病的间接调控作用如：肠道菌群调节、外泌体调节等，同时拓宽人参汤的用药思路。