馒头色泽与质构性状的GWAS分析

吴 澎 刘 娟 陈广凤 赵子彤杨 艺 李向阳 唐晓珍 田纪春

(山东省高校食品加工技术与质量控制重点实验室；山东农业大学食品学院1，泰安 271018)(德州学院生态与景观学院2，德州 253023)(山东农业大学小麦品质育种研究室；山东省作物生物学重点实验室3，泰安 271018)

馒头是我国北方人民的主要面制食品，其消费量占全国面制品消费量的一半，在人们膳食结构中占有非常重要的地位[1]。馒头的质构与色泽性状作为影响馒头品质的两个非常重要的因素，一直被看做评价馒头质量好坏的指标。目前，国内虽已有许多有关馒头质构性状与色泽性状的研究[2-5]，但相较于国外学者对面包品质从遗传机理到加工过程都进行大量深入细致的系统研究，并应用到栽培及加工实践的现状，国内学者对馒头的研究深度较小，且多数局限于原料、配料和工艺条件对馒头品质的影响[6-10]，对馒头品质遗传机理方面的研究几乎是空白。随着近几年分子标记在小麦等植物育种中的1成功运用[11-16]，从分子角度对影响馒头各性状的基因进行分析成为研究热点。

全基因组关联分析(genome-wide association study, GWAS)是近年来在植物育种中应用比较广泛的分析技术，它是基于连锁不平衡原理对目标性状与遗传标记或候选基因进行分析，从而准确定位与目标性状相关的基因位点[17-18]。与基因重组分析方法比较，关联分析具有高通量、检测速度快、精度高的特点，已经成功应用于玉米[20]、水稻[21]、拟南芥[22]、油菜[23]、大麦[24]等重要作物。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)标记作为新型的第三代分子标记，与传统分子标记相比SNP具有数量多、分布广和密度高的特点，能在待测基因的附近和内部提供一系列标记，可极大的提高关联分析的统计效力[25-26]。本实验通过全基因组关联分析对影响馒头质构与色泽性状的基因位点进行研究，旨在从分子层面比较馒头感官性状间的差别，为下一步结合小麦分子育种筛选优良馒头小麦品种提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料及表型鉴定

实验群体由来自不同国家和省份的205份小麦品种构成，包括55个骨干亲本和73个高代品系。其中203份来自于我国种植冬小麦的10个省份，2份分别来自于法国跟墨西哥(见表1)。

表1 供试小麦材料

在2014年和2015年间，分别将供试小麦种植于山东德州实验点(德州市农业科学院)和山东泰安实验点(山东农业大学)，每份小麦品种播种3行，行长2 m，行与行之间间隔25 cm，重复2次。小麦生长期间，对试验田进行常规管理，没有出现严重的病虫害和倒伏现象。待小麦成熟后，将其收割、编号，研磨成面粉，并按传统方法制作成馒头。

待馒头冷却后，平放于桌面上，取每个馒头外表皮的表面顶端为外表面色泽测量点，选取的外表面测量点要求平整光滑，以确保所测结果的准确性。用色差仪测量其L*、a*、b*值，重复3次。测量结束后，用切割机将馒头平行切割成三片，取中间片的内瓤中间位置作为内表面测量点，测量其L*、a*、b*值，重复3次。测量结束后，取馒头中间片置于质构仪上，在TPA模式下采用P35探头进行压缩实验[27]，测试前速率3.00 mm/s，测试速率1.0 mm/s，测试后速率1.0 mm/s，下压程度50%。第一次压缩结束后，探头回到起始位置，等待3 s后进行第二次压缩。采用SPSS18.0软件对表型数据进行分析。

1.2 DNA提取和90 K SNP 芯片分型

依照稍作修改的Triticarte方法从小麦幼叶中提取DNA，并用0.8%的琼脂糖电泳对提取DNA的浓度与质量进行检测。委托加利弗尼亚大学生物技术检测中心，利用最新开发的90K SNP基因芯片对群体DNA进行分型，通过GenomeStudio软件读取分型结果并保存。同时，为确保获得的基因数据的质量，用PLINK v1.07[28]对基因数据进行处理，去除检出率小于0.8和低频基因频率小于0.05的标记，最终得到24 355个标记用于馒头色泽和质构关联分析。

1.3 性状和标记关联分析

运用TASSEL 3.0 软件中的MLM模型分别对目标性状(色泽、质构)与标记之间进行关联分析。结果中关联标记的P<0.001时，表明该标记与目标性状存在显著关联；P<0.000 1时，表明该标记与目标性状存在极显著关联。当标记在2个及以上环境中同时被检测到则认为其是目标性状相对稳定的关联位点。

2 结果与分析

2.1 色泽与质构性状表型变异比较分析

馒头色泽的6个相关性状与质构的7个相关性状在群体中的表型数据分别如表2和表3所示。四个环境中，各性状的变异系数表现不同，色泽相关性状中E1环境内表面a*值变异系数最大(71.73%)，E4环境外表面L*变异系数最小(3.70%)；而质构相关性状中E1环境黏着性变异系数最大(58.50%)，弹性变异系数最小(3.21%)。并且，色泽与质构相关性状的峰度与偏度绝对值大部分都小于1，基本符合正态分布，属于数量性状遗传，适合进行关联分析。

表2 四个环境下馒头色泽相关性状在群体中的表型数据

注： E1：2014年泰安点；E2：2014年德州点；E3：2015年泰安点；E4：2015年德州点；内L*：内色差L*值；内a*：内色差a*值；内b*：内色差b*值；外L*：外色差L*值；外a*：外色差a*值；外b*：外色差b*值。

表3 四个环境下馒头质构相关性状在群体中的表型数据

注：E1：2014年泰安点；E2：2014年德州点；E3：2015年泰安点；E4：2015年德州点。

2.2 色泽性状的关联分析

通过对性状与标记的关联分析，在P<0.001水平(显著水平)上，4个环境中共检测到276个馒头色泽性状关联位点，其中23个极显著(P<0.000 1)关联位点，9个相对稳定(至少在2个环境中同时被检测到)关联位点，30个高遗传贡献率位点(R2>10%)，分布于小麦21条染色体中的13条(1A、1B、1D、2A、2B、3A、3B、4A、5B、6A、6D、7A 和7D)，单个位点表型变异贡献率为7.00%～14.07%。位于7A染色体上的极显著位点Kukri_c18677_823表现出最大的表型变异贡献率，可解释14.07%的表型变异，但只在E4环境中检测到(见表4)。

表4 4个环境中与馒头色泽相关性状极显著 (P<0.000 1)、高贡献率和稳定位点

2.3 质构性状多效性关联位点

在与馒头质构性状显著关联的位点中(P<0.001)，同时与2个及2个以上性状存在关联的位点被称为多效性关联位点(表5)。23个控制馒头质构相关性状多效性关联位点及贡献率见表5。其中，染色体2D上位点Kukri_c13329_800和7A染色体上位点wsnpcEx_c14654_22713386与咀嚼性、黏聚性、硬度、回复性4个性状同时关联，染色体2B上位点Tdurum_contig14707_251与咀嚼性、硬度、胶著性3个性状同时关联，与3个性状同时关联的还有染色体4B上位点Tdurum_contig4974_355和染色体7D上位点D_contig06359contig118，其余18个位点分别同时控制质构相关性状的2个性状。

3 讨论

馒头的色泽与质构性状是衡量馒头品质优良的重要指标之一，不同的小麦品种及环境都会对成品的表型有一定的影响。本研究得到6个色泽相关性状，7个质构相关性状在4个不同环境下的表型数据。数据表明各性状均表现出不同的变异系数，外表面a*值、内表面a*值、硬度、黏着性、胶着感和咀嚼性6个性状的遗传变异系数大于20%，表明其遗传变异丰富，相较于其余性状，这6个性状具有较大的改良潜力。遗传变异系数处于10%～20%之间的性状有外表面b*、内表面b*、回复性3个性状。本实验群体在以上性状具有比较丰富的遗传变异，表明利用冬小麦资源对馒头色泽、质构性状改良具有较大的潜力。

本研究利用24 355个SNP位点以及MLM模型对馒头质构与色泽性状进行关联分析，在显著水平下检测到较多的关联位点。一方面说明了检测位点较为全面，另一方面也表明了该实验群体的遗传变异较为丰富。环境因素对作物基因的表达有重要的影响，关联位点的表达分为两类，一类为环境间特异性表达，另一类为多种环境下稳定表达。本实验设置4个不同环境E1、E2、E3、E4，并将在两个及以上环境中表达的关联位点定义为相对稳定的关联位点。通常，关联分析结果中显著性较大的位点与性状的关联度较高，假阳性的概率低，因此，本实验将显著性较大的位点(P<0.000 1)定义为极显著关联位点。相对稳定关联位点与极显著关联位点都对研究馒头质构性状有较大的意义，因为基因位点的研究目的是将所得性状位点信息最终应用于分子辅助育种上。

表5 馒头质构多效性关联位点

4 结论

利用分布于小麦全基因组的24 355个SNP位点对205份不同小麦粉馒头的色泽和质构性状进行全基因组关联分析。检测到276个馒头色泽性状显著关联位点，其中23个极显著(P<0.000 1)关联位点，9个相对稳定关联位点，30个高遗传贡献率位点(R2>10%)，分布于小麦的13条染色体。检测到23个与馒头质构性状存在显著关联的多效性位点，分布于小麦的15条染色体。这些关联位点与多效性位点的获得，有助于从分子层面理解馒头感官性状间的差别，并可进一步结合分子育种技术改良馒头用小麦品种。