天津市区公园土壤样品中弓形虫污染情况的调查

徐环，董苏洁，赵振楠，苏苗，钱丽敏，宋淇淇



天津市区公园土壤样品中弓形虫污染情况的调查

徐环，董苏洁，赵振楠，苏苗，钱丽敏，宋淇淇通信作者

（天津农学院 动物科学与动物医学院，天津 300384）

对天津市区不同公园土壤样品中弓形虫卵囊的污染情况进行调查，选取弓形虫的高拷贝DNA片段B1基因作为诊断基因，以天津市内六区共35个公园及5所高校的土壤样品作为研究对象，提取土壤样品中的基因组DNA，利用PCR方法对春夏季节以及秋冬季节的土壤样品中弓形虫卵囊的污染情况进行检测。结果表明：春夏季节土壤样品中弓形虫卵囊的阳性率为11.11%（10/90），秋冬季节土壤样品中弓形虫卵囊的阳性率为2.22%（2/90），弓形虫卵囊污染情况呈季节性变化，从春夏季节到秋冬季节呈逐渐下降的趋势。

弓形虫；天津市区；公园；土壤样品；污染

弓形虫病是一种呈全球性分布的重要食源性人兽共患寄生虫病。此病呈世界性分布，全球人群弓形虫的感染率约为25%～50%，有些地区感染率高达80%以上，估计全世界有约5亿～10亿人感染过弓形虫[1]。该病在流行病学上具有两大特点：一、广泛流行性，即除南极洲外，世界各大洲都有流行，是一种全球性寄生虫病；二、多宿主性，弓形虫可侵袭所有哺乳动物、鸟类、爬行类和冷血动物等。孕妇感染弓形虫病可引起早产、流产，甚至死胎[2]；艾滋病患者感染可导致严重的并发症，甚至死亡；动物感染表现为免疫力低下、生长缓慢、消瘦、贫血等，严重时也可导致死亡[3]。由此，弓形虫对人类社会构成两大威胁，一是对人类健康和优生优育造成严重威胁，二是引起猪、羊等多种家畜流产、死胎等繁殖障碍性疾病，给畜牧业造成巨大损失[4]。

弓形虫病有多种传播途径，其中被弓形虫卵囊所污染的土壤被认为是弓形虫病的主要传染源之一，因此对土壤中弓形虫污染情况进行调查对控制弓形虫病的传播具有一定的公共卫生学意义。本项目以天津市区各大公园的土壤样品为研究对象，用PCR方法对不同季节土壤样品中弓形虫卵囊的污染情况进行检测，从而对天津市区公园土壤中弓形虫的感染现状进行分析，将有助于人们进一步重视该病，并为该病的防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

天津市内六区35个公园以及5所高校的土壤样品。

1.1.2 主要试剂

土壤基因组提取试剂盒（美国OMEGA公司）；琼脂糖（上海捷瑞生化科技有限公司）；DNA聚合酶（Takara公司）；dNTPs（Takara公司）；DNA Marker（北京全式金生物技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 土壤样品的采集

2017年5月在天津市区38个公园及7所高校共采集春夏季土壤样品90份，具体采样地点见表1。

表1 天津市内六区具体采样地点

在此次样品采集中每个采样地点各采集土壤样品两份。每份样品采集地表至地下5 cm的土壤，在所选区域采集5个点进行混合，生成一份土壤样品代表该区域的土壤检测样本，并对该采集样本的所在地进行样本的记录备注[4]。2017年11月在采样地点再次采集秋冬样品90份，方法同上。

1.2.2 土壤样品的预处理

土壤中含有大量的杂质，如较大的石块、植物的根茎、烟头等都有可能混合于土壤样本中，样本采集区土壤环境的干燥与湿润情况也会影响试验。因此需要对土壤样品进行风干与筛选。将所采集回来的样品平铺在干净的纸上，置于干燥阴凉的地方通风，经常翻动使样品加速干燥。此步骤是为了确保实验中能够加入足量的土壤样品，而不受土壤中水分的影响。

当样品干燥后对其进行过筛。首先将样品中较大的土块对其进行粉碎，释放出可能被包含在其中的弓形虫卵囊，然后将所研磨粉碎过的土壤经过10目筛筛选[5]。经筛后的土壤样品保存备用。

1.2.3 土壤样品基因组DNA的提取

（1）称取0.5 g玻璃珠加入1.5 mL离心管中，然后再称取0.7 g土壤样品加入到该离心管中，再向该离心管中加入试剂盒中的SLX-Mlus Buffer试剂1 mL，涡旋以裂解样品；

（2）向涡旋过的离心管再加入DS Buffer进行短暂的涡旋使其完全混合；

（3）将离心管置于70 ℃水浴锅中水浴10 min，在水浴过程中进行短暂涡旋；

（4）室温3 000 g离心3 min。离心完毕后将试管小心取出，切勿打乱沉淀；

（5）转移800 μL上清液置于新的2 mL离心管中，然后向其中加入270 μL P2 Buffer，将其涡旋使其完全混合；

（6）将涡旋好的2 mL离心管于冰上孵育5 min；

（7）4 ℃以13 000 g离心5 min；

（8）小心将上清液转移至新的2 mL离心管中；

（9）向离心管中加入0.7倍体积的异丙醇，反复颠倒20～30次使其与上清液完全混合；

（10）4 ℃以13 000 g离心10 min，小心弃去上清液；

（11）将离心管倒扣于吸水纸上约1 min，使其吸去管中的液体；

（12）向管中滴加200 μL Elution Buffer后涡旋10 s。再在水浴锅中孵育10～20 min以溶解DNA沉淀；

（13）加入HTR试剂（该试剂在使用之前应垂悬混匀）100 μL。涡旋混匀。并在室温下放置2 min；

（14）以13 000 g离心2 min。将清亮的上清液转移到新的2 mL离心管中；

（15）加入等体积的XP1 Buffer试剂，涡旋以混匀；

（16）将上步中涡旋后的液体加入到HiBind DNA Mini Column管中；

（17）在室温下以10 000 g离心1 min。弃去滤液，但Collection Tube不能弃去；

（18）再向HiBind DNA Mini Column管中加入300 μL XP1 Buffer试剂；

（19）10 000 g离心1 min，弃去滤液以及Collection Tube管；

（20）将HiBind DNA Mini Column管转移到新的2 mL Collection Tube管上；

（21）向HiBind DNA Mini Column管加入700 μL SPW Wash Buffer试剂，10 000 g离心1 min；

（22）弃去滤液，但Collection Tube保留；

（23）重复步骤21～22，进行二次洗涤；

（24）将空的HiBind DNA Mini Column管在室温下于13 000 g离心2 min；

（25）转移HiBind DNA Mini Column至新的1.5 mL离心管上。加入100 μL已在70 ℃水浴锅预热的Elution Buffer试剂于HiBind管的洗脱膜中央，65 ℃水浴5 min；

（26）13 000g离心1 min以洗脱DNA；

（27）重复25～26步骤，进行二次洗膜；

（28）弃去HiBind DNA Mini Column管，将所获得的DNA置于-20 ℃保存备用。

1.2.4 PCR引物的合成及PCR扩增体系

扩增所采用的基因序列为弓形虫的B1基因[6]。其引物序列如表2所示。

表2 PCR扩增引物序列

向0.2 mL小管中加入10×PCR Buffer、上游引物、下游引物、dNTPs、DNA模板、聚合酶，最后加入ddH2O将其总反应体系补齐至25 μL。放至离心机中进行短暂的离心。阳性对照为弓形虫的DNA基因组，阴性对照为重蒸水。扩增体系见表3。除此之外，还要向扩增体系中加入终浓度为400 ng/μL的BSA，以抑制土壤样品中可能存在的PCR扩增抑制因子。

表3 PCR反应的扩增体系 μL

1.2.5 PCR反应程序及PCR扩增产物的检测

PCR反应程序：（1）95 ℃预变性10 min；（2）94 ℃变性30 s；（3）54 ℃退火30 s；（4）72 ℃延伸30 s；（5）重复步骤（2）（3）（4）共30个循环；（6）72 ℃过延伸10 min；（7）15 ℃保温。扩增结束后进行凝胶电泳检测，或置于4 ℃备用。

PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测：取PCR扩增产物5～8 μL加入至1.5%琼脂糖凝胶样品孔中，通电后进行电泳，待电泳结束后，在凝胶成像系统观察结果。

1.2.6 PCR扩增产物的测序

将PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，切割下带有单一目的片段的凝胶块，利用试剂盒进行DNA回收。将回收产物与T载体进行连接，转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化后的菌液涂布于培养皿中，8～12 h后观察菌落形态。于超净台将单个阳性菌落挑下后对其进行PCR鉴定，对鉴定正确的阳性菌株进行测序。

2 结果与分析

2.1 PCR检测结果

电泳检测结果如图1所示，检测结果显示，在90份秋冬季节土壤样品中有2份样品成功扩增出194 bp目的条带。

图1 弓形虫卵囊B1基因的PCR扩增图

注：M为DNA Marker；1，2为PCR检测阳性结果；3为阴性对照；4为阳性对照

2.2 PCR扩增产物的测序结果

PCR扩增产物的测序结果如下：

5＇-TATAAGA AAAAAATGTGGGAATGAAAGAGACGCTAATGTGTTTGCATAGGTTGCAGTCACTGACGAGCTCCCCTCTGCTGGCGAAAAGTGAAATTCATGAGTATCTGTGCAACTTTGGTGTATTCGCAGATTGGTCGCCTGCAATCGATAGTT-3＇

产物长度为194 bp，将此序列与NCBI数据库中所报道的弓形虫B1基因序列相比对，符合率为100%。

2.3 不同季节土壤中PCR检测结果

90份春夏季土壤样品中共检测到10份阳性样品，阳性率为11.11%（10/90）；90份秋冬季土壤样品中共检测到2份阳性样品，阳性率为2.22%（2/90）。

3 讨论

目前用PCR方法检测弓形虫的靶基因有P30基因、B1基因以及529 bp片段等，其中B1基因和529 bp片段在检测中最为常用。B1基因是由Burg等[7]对RH株弓形虫基因文库进行筛选得到的大小为2.2 kb、大约有35拷贝的片段，此序列高度保守，有高度敏感性和特异性。529 bp片段是由Homan等[8]鉴定出的弓形虫基因组中重复200～300次的基因片段。在本次试验中，采用B1基因作为此次PCR方法的诊断基因。

近几年来，关于土壤中弓形虫的报道各有差别，阳性率也相差较大。人们发现，随着研究的深入，弓形虫病的流行表现出许多新特点，危害远远高出人们的估计。从此次调查结果来看，天津市各大公园和高校土壤样品弓形虫卵囊检测显示，秋冬季阳性率2.22%（2/90），春夏季阳性率11.11%（10/90），说明了公园土壤中弓形虫卵囊污染情况呈季节性变化，并且土壤一年四季都受到弓形虫卵囊的污染，且从春天到秋天呈现逐渐下降的趋势。因此，春夏季可能具有较高的通过土壤感染弓形虫的几率[9]。

研究表明，弓形虫感染呈世界性分布，特别集中于温暖、潮湿和低海拔地区，卵囊在温暖、干燥的环境中存活率会下降[10]。在波兰的人类弓形虫病流行病学中，被弓形虫卵囊污染的土壤可能会对人和动物造成一定的危害，不同地区土壤弓形虫阳性率的差异和当地的气候条件、卫生状况及户外活动频繁程度均有一定的关系[11]。国内有学者对湖北武汉地区部分公园的土壤样品中弓形虫卵囊的污染情况进行了调查，冬季样品的弓形虫卵囊阳性率为6.35%（6/53）[12]，兰州市公园土壤夏季弓形虫阳性率12.0%[13]。而根据此次的调查结果，天津地区公园冬季的弓形虫卵囊阳性率要低于之前的报道。其原因可能在于南北方的气候差异，天津市地理位置相对纬度高，相比湖北的冬季气候环境，天津的冬季气温处于0℃以下，土壤发生冻结，其土壤的环境可能不适合弓形虫卵囊的生存，使得此次弓形虫检测的阳性率很低，仅为2.22%；而天津春夏季节气候温暖且少雨，与兰州春夏季气候相差不大，以至于其阳性率相近。虽然是说冬季阳性率偏低，但是在检测中，也同样检测到了弓形虫卵囊的存在，说明天津市公园土壤中也同样有弓形虫的存在，并且对周围市民以及动物的生活产生了一定的健康隐患。同时在没有检测到的地区也不能说该地区没有弓形虫的存在，有可能在采集样品中刚好未采集到含有弓形虫卵囊的土壤，或者采集样品中以前可能存在过弓形虫的卵囊，只是卵囊可能已经死亡崩解，使检测结果呈现阴性。

总之，本研究表明天津市各大公园和高校的土壤中存在弓形虫卵囊，为土壤可能是人和动物感染弓形虫的传染源提供了可靠的证据。因此，对土壤中弓形虫卵囊的监测是减少人和动物受弓形虫感染的有效措施。弓形虫感染已日益受到人们的关注，应增强预防意识，大力普及本病知识，提倡健康理念，保持良好的生活习惯和饮食方式，注意生活卫生，切断传染源，从根本上预防弓形虫病的发生。

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责任编辑：张爱婷

Investigation ofcontamination in soil samples of parks in urban areas of Tianjin city

XU Huan, DONG Su-jie, ZHAO Zhen-nan, SU Miao, QIAN Li-min, SONG Qi-qiCorresponding Author

（College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

In order to investigate the contamination status ofin soil samples of parks in urban areas of Tianjin city, high copy DNA fragment B1 gene ofwas selected to be the diagnostic gene, and soil samples from thirty five parks and five universities were studied as research objects. Genomic DNA was extracted from the soil samples, and the contamination status ofoocyst in soil samples from spring-summer months and autumn-winter months were detected by PCR method. The results showed that the positive rate of soil samples from spring-summer months was 11.11%（10/90）, while the positive rate of soil samples from autumn-winter months was 2.22%（2/90）. The contamination ofwas seasonal, and there is a downward trend from spring-summer months to autumn-winter months.

; urban areas of Tianjin city; parks; soil samples; contamination

1008-5394（2018）04-0048-04

10.19640/j.cnki.jtau.2018.04.011

S855.9

A

2018-05-14

天津市教委科研计划项目（2018KJ185）；天津农学院大学生创新训练计划项目（201710061186）；天津农学院科学研究发展基金（2014N10）；国家自然科学基金项目（31702223）

徐环（1998-），女，本科在读，主要从事动物医学方面的研究。E-mail：1377924594@qq.com。

宋淇淇（1986-），女，讲师，博士，主要从事兽医寄生虫学教学及研究工作。E-mail：qqs0606@163.com。