种子类药材中二氧化硫残留量的滴定法检测对比

陈建茹，董伟伟，焦晓林，彭娟，吴馨琰，蒋宁，韩雪，高微微*

(1.上海同济堂药业有限公司，上海 201707；2.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所，北京 100193)

硫磺熏蒸是部分中药材传统加工和保管养护的常用方法，硫熏时产生的二氧化硫具有干燥、漂白、防霉、防虫和延长贮藏期等作用[1]。近年来，药材中残留的二氧化硫对人体健康带来的危害引起广泛关注[2-4]。2005年版《中华人民共和国药典》删除了山药、葛根和湖北贝母3个品种中硫磺熏蒸的加工方法[5]，并于2008年增补本开始收载了酸蒸馏-碘滴定法(Iodine Titration，IT法)测定二氧化硫残留量[6]；2010年版《中华人民共和国药典》将该检测方法收录于附录IX U[7]；2012年发行的第一增补本对方法进行了修订[8]；2013年发行的第二增补本首次对中药材及饮片二氧化硫残留量进行了限定，规定除山药、牛膝、粉葛、天冬、天麻、天花粉、白及、白芍、白术、党参10种中药材及其饮片中二氧化硫残留量不得超过400 mg·kg-1以外，其他非矿物类中药材及饮片二氧化硫残留量不得超过150 mg·kg-1[9]。2015年版《中华人民共和国药典》延续了上述规定，同时将第四部通则2331收录的测定二氧化硫残留量的滴定法由IT法改为酸碱滴定法(Acid-base titration，ABT法)[10]。目前，虽然IT法不再被药典收录，但与现行的食品安全国家标准《食品中二氧化硫的测定(GB 5009.34—2016)》较为类似[11]，近两年的文献中仍有研究者用于检测中药材、食品等[12-13]，IT法与ABT法对样品测定结果的影响尚未见报道。

采用硫磺熏蒸的药材品种多为不易干燥及易虫蛀霉变或褐变的根及根茎类、花类以及动物性药材[14-15]，种子类药材较少使用硫熏工艺。我们前期在样品检测中发现，大多数深色种子类药材很少检出二氧化硫，但十字花科的药材具有特殊性，未经硫熏的药材利用IT法仍能检测到二氧化硫。由于十字花科的中药材大多含有硫代葡萄糖苷(硫苷)类化合物及其降解产物[16-17]，这些含硫化合物的存在对二氧化硫残留量测定结果可能会产生影响。本文采用IT、ABT两种滴定法，对7种种子类药材共100个批次样品进行二氧化硫含量测定；对其中二氧化硫检出率较高的十字花科种子类药材莱菔子与芥子，选取同一批药材样品对比两种滴定法检测结果的差异，并采用ABT法比较药材炒制前后的二氧化硫含量，为种子类药材的质量评价提供参考。

1 材料和方法

1.1 供试药材

于2014—2018年期间收集7种种子类药材共100个批次的样品，包括莱菔子7个批次，炒莱菔子6个批次，芥子8个批次，炒芥子4个批次，沙苑子12个批次，紫苏子7个批次，急性子5个批次，女贞子26个批次，补骨脂25个批次。每份样品各取50 g左右，粉碎，过80目筛，于样品收集后的3天内完成二氧化硫残留量的检测。

1.2 仪器与试剂

电子天平(FA2004B，0.000 1 g，上海精科天美科学仪器有限公司)，粉碎机(111B，瑞安市永历制药机械有限公司)，可调温电热器(TC-15，海宁市华星仪器厂)，磁力搅拌器(H05-1，上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司)，25 mL酸式滴定管，10 mL碱式滴定管，碘滴定液(0.01 mol·L-1)，氢氧化钠滴定液(0.01 mol·L-1)，甲基红指示剂(2.5 mg·mL-1乙醇溶液)，氮气(纯度99.99%)，盐酸、可溶性淀粉均为分析纯。

1.3 碘滴定法(IT法)

参照2010年版《中华人民共和国药典》第一增补本附录IX U项下“碘滴定法”进行。精密称取药材粉末10 g，置两颈圆底烧瓶中，加水400 mL，在刻度分液漏斗中加入6 mol·L-1盐酸溶液10 mL，锥形瓶内加入水125 mL和淀粉指示液1 mL作为吸收液，置于磁力搅拌器上不断搅拌。打开冷凝管，在其上端连接导气管置于锥形瓶内。连接氮气设置气体流量为0.20 L·min-1。将分液漏斗中的10 mL盐酸加至两颈烧瓶中，加热至沸，保持微沸约3 min后开始用碘滴定液滴定，至蓝色或蓝紫色持续30 s不完全消褪，并将滴定结果用空白试验校正。每1 mL滴定液相当于0.640 6 mg的二氧化硫。

1.4 酸碱滴定法(ABT法)

参照2015年版《中华人民共和国药典》四部项下“酸碱滴定法”进行。以50 mL 3%过氧化氢溶液作为吸收液，使用前，在吸收液中加入3滴甲基红乙醇溶液指示剂，并用0.01 mol·L-1氢氧化钠滴定液滴定至黄色。与IT法采用相同的方式加热，气体流量为0.20 L·min-1，两颈烧瓶中的溶液沸腾后保持微沸1.5 h后，停止加热。将吸收液放冷，置于磁力搅拌器上不断搅拌，用氢氧化钠滴定液滴定至黄色持续时间20 s不褪，并将滴定的结果用空白实验校正。每1 mL滴定液相当于0.32 mg的二氧化硫。

1.5 两种滴定法检测莱菔子、芥子的对比实验

选取2个批次莱菔子及2个批次芥子样品，精密称取药材粉末10 g，分别用IT法、ABT法检测二氧化硫的含量，每批次样品重复测定2次。

1.6 莱菔子及芥子炒制前后二氧化硫含量测定

选取3个批次莱菔子及3个批次芥子样品，采用ABT法检测炒制前后药材中的二氧化硫含量。

1.7 数据分析

采用SPSS 20软件中的配对t检验法比较两种滴定法的检测结果、药材炒制前后的二氧化硫检测数据。

2 结果与分析

2.1 不同批次种子类药材二氧化硫检测结果

2014—2015年参照2010年版《中华人民共和国药典》第一增补本，利用IT法检测了49个批次种子类药材的二氧化硫残留量。表1中列出了有检出的13个批次的结果，其中来源于十字花科的种子类药材莱菔子、芥子二氧化硫的检出率高达100%，且检出量均超出2010年版《中华人民共和国药典》增补版限量标准(≤150 mg·kg-1)。检出量最高的样品二氧化硫含量高达1650 mg·kg-1(炒莱菔子150501)。其他5种非十字花科的37批种子类药材仅1批次沙苑子检出二氧化硫(表1)，其余5批次沙苑子、3批次紫苏子、3批次急性子、9批次女贞子、16批次补骨脂均未检出。

2015年版《中华人民共和国药典》实施之后，自2015年11月起采用ABT法检测了51个批次种子类药材的二氧化硫残留量。其中13批十字花科莱菔子(7批)、炒莱菔子(1批)、芥子(4批)、炒芥子(1批)二氧化硫的检出率为53.8%，仅1批次的炒芥子(151201)超出2015年版《中华人民共和国药典》限量标准，检出量为256 mg·kg-1(表1)。其他5种非十字花科的38批种子类药材，仅1批次补骨脂检出二氧化硫(表1)，其余6批次沙苑子、4批次紫苏子，2批次急性子、17批次女贞子、8批次补骨脂均未检出。

表1 不同批次种子类药材二氧化硫测定阳性样品及测定结果

注：ND表示未检出；—表示产地未知。

2.2 两种滴定法对莱菔子、芥子检测结果的对比

对于二氧化硫检出率较高的十字花科种子类药材莱菔子、芥子，采用配对t检验分析对比IT法与ABT法的检测结果。ABT法对2批次莱菔子、2批次芥子的检测值均高于IT法，莱菔子的检测结果高出42.8%、5.9%；芥子的检测结果高出360%、178%。但配对t检验的结果表明两种滴定法的检测结果无显著差异(P>0.05，表2)。

表2 IT法与ABT法对莱菔子和芥子的测定结果对比

2.3 炒制对莱菔子、炒芥子二氧化硫检出量的影响

采用ABT法检测莱菔子、芥子炒制前后的二氧化硫含量，莱菔子炒制前后的数据配对t检验P值为0.872，表明炒制前后结果无显著差异(P>0.05，表3)；芥子炒制前后配对t检验P值为0.032，表明炒制后二氧化硫检出量显著高于炒制前(P<0.05)。

表3 莱菔子和炒芥子炒制前后二氧化硫的检出量

注：ND表示未检出。

3 讨论

硫磺熏蒸中药材的过程中，硫磺燃烧产生二氧化硫，与药材中的水分结合生成亚硫酸盐等物质，残留在中药材中[18]。两种滴定法的反应原理均为利用亚硫酸盐与盐酸在加热条件下生成二氧化硫气体，通过吸收液进行收集，再用滴定液进行滴定并计算。种子类药材在收获后不用硫熏，本实验结果表明，沙苑子、紫苏子、急性子、女贞子、补骨脂等非十字花科种子类药材均未检出二氧化硫残留，而十字花科种子类药材莱菔子、芥子大部分样品中均能检出二氧化硫，原因在于莱菔子含有萝卜苷和莱菔子素，芥子含有白芥子苷、芥子碱硫氰酸盐等硫苷及其衍生物[19-20]，这些含硫化合物在加热情况下也可降解生成二氧化硫[21]，从而导致阳性结果，并不代表药材用硫熏蒸过。

本实验结果中，2015年11月之前利用IT法检测的5批次炒莱菔子二氧化硫含量均高于400 mg·kg-1，而2015年11月之后用ABT法检测的7批莱菔子有检出的批次二氧化硫含量均在106 mg·kg-1以下，原因一方面与炒制有关，另一方面与两种方法本身的差异有关。对同一批芥子的炒制结果证实芥子炒制后二氧化硫检出量显著升高(P<0.05)，原因可能是炒制导致药材中含硫成分转化造成的[22]。另外，十字花科种子类药材中硫苷类成分含量还与药材产地、品种等有关[23-25]，可能也是不同批次十字花科种子类药材二氧化硫检出量存在差异的原因。

IT法与ABT法的差异在于吸收液与滴定液不同，加热时间也存在差异，IT法边加热边滴定，加热时间受样品释放二氧化硫的总量与速率有关，而ABT法的加热时间固定为1.5 h。本研究结果表明，ABT法对莱菔子、芥子的检测结果高于IT法，推测可能的原因与两方法中加热时间不同，样品中硫苷分解生成的二氧化硫量有差异有关，但两种方法的检测结果未达到显著差异(P>0.05)。两种方法的差异需进一步增加样本量确认。另外，2015版《中华人民共和国药典》除滴定法以外，还增加了离子色谱法与气相色谱法，这3种方法中以滴定法操作最为简便，成本也最低，应用较为普遍，其他两种方法受仪器昂贵、技术要求高、样品前处理复杂的限制，多出现在研究报道中，在生产企业中应用较少[26]。从检测结果的精确性和准确性考虑，在今后的工作中有必要对3种方法在十字花科药材上应用的一致性进行确认。