当归粉末显微鉴别特征的ATR-FTIR光谱成像识别△

张久旭，翟小林，王丹，裴纹萱，董玲，孙裕，宋学斌，陈建波*，王晶娟*

(1.北京中医药大学 中药学院，北京 102488；2.北京中医药大学 生命科学学院，北京 100029；3.兰州佛慈制药股份有限公司，甘肃 兰州 730046)

当归是伞形科植物当归Angelicasinensis(Oliv.)Diels.的干燥根[1]，其作为传统的药食两用品种，产销量大，价格较高，经常出现掺假混伪等问题。因此，建立快速准确的鉴别方法，实现全程质量控制，对于保证当归在药用或者食用时的真实性、有效性和安全性都是非常必要的。2015年版《中华人民共和国药典》(《中国药典》)规定了当归粉末的显微鉴别特征，包括薄壁细胞、导管和油室碎片。根据相关文献，当归粉末的显微鉴别特征还包括淀粉粒和木栓细胞[2-3]。基于细胞和组织形态特征的显微鉴别法是中药粉末鉴定的基本方法之一；但是，中药粉末显微鉴别主要以组织、细胞和细胞后含物的形状、颜色等物理性质为依据，这些显微结构的细节多变，难以建立客观量化的识别规则，判断标准比较模糊，鉴定结果非常依赖于操作者的知识经验和主观判断。因此，有必要发展更加客观量化的显微特征检测技术。本研究即以衰减全反射傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)显微成像技术为基础，建立当归粉末显微鉴别特征的化学检测方法，进一步提高当归显微鉴别方法的客观性和准确性。

中药粉末里很多显微结构的形状、颜色等物理性质可能具有多变的细节，但是其化学组成相对稳定。例如，茯苓粉末里分枝状团块的具体形状有很大差异，但主要都是由β-葡聚糖类成分组成[4]。因此，根据中药粉末显微结构的化学特征对其进行识别，可以作为形态特征识别的补充方法，提高显微鉴别法的客观性和准确性。随着仪器技术的进步，很多以光谱、能谱或质谱为基础的显微化学分析技术不断发展成熟并得到广泛应用。相比于其他方法，显微红外光谱在中药显微化学分析方面具有一些显著的优势：首先，红外光谱是直接、无损的分析技术，不需要分离提取或分子标记处理，容易与常规光学显微分析相结合；其次，红外光谱可以作为指纹图谱同时反映样本中全部成分的整体信息，而不是只检测个别成分；再者，显微红外光谱可以达到微米级空间分辨率，而且具有很快的测试速度，能够快速寻找到细胞或组织水平的特征显微结构。因此，显微红外光谱技术近年来已经在中药显微化学分析方面得到越来越多的应用[5-12]。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所用当归药材样品于2015年采集自甘肃漳县(1号样品)、岷县(2号样品)和渭源县(3号样品)，经北京中医药大学中药学院王晶娟副教授鉴定为伞形科植物当归Angelicasinensis(Oliv.)Diels.的干燥根。当归样品粉碎后过60目筛，粉末直接进行红外光谱测试。当归挥发油提取按照2015版《中国药典》四部通则2204挥发油测定法中的乙法进行。分析纯蔗糖、淀粉、草酸钙(国药集团化学试剂有限公司)，藁本内酯对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111737)。

1.2 常规红外光谱测试

常规红外光谱测试所用仪器为PerkinElmer Frontier FT-IR/NIR光谱仪及其配套的UATR附件，DTGS检测器。使用衰减全反射(ATR)方法测量样品的红外光谱，光谱测量范围4000～650 cm-1，分辨率4 cm-1，每张光谱累加扫描16次，使用空气作为光谱背景，扫描过程中自动扣除水蒸气和二氧化碳干扰。样品原始测量光谱经过PerkinElmer Spectrum v10软件的ATR校正、自动基线校正和归一化处理后进行谱图分析。

1.3 显微红外光谱测试

显微红外光谱测试使用PerkinElmer Frontier FT-IR/NIR光谱仪与PerkinElmer Spotlight 400 FT-IR Microscope所组成的红外光谱显微成像系统以及配套的ATR光谱成像附件进行，使用液氮冷却的MCT线阵列检测器。当归样品粉末直接放在不锈钢底板上进行测试，单次测试区域500 μm×500 μm，像素尺寸6.25 μm×6.25 μm，光谱范围4000～750 cm-1，光谱分辨率8 cm-1，每张光谱累加扫描8次，空白底板作为光谱背景。使用PerkinElmer Spectrum IMAGE v1.7软件对原始测量光谱进行ATR校正和空气背景校正，然后以2100～2000 cm-1区域为参考波段进行基线平移校正。显微光谱的主成分分析使用Spectrum IMAGE软件进行，偏最小二乘投影使用MATLAB 2016b软件和自编程序进行。

2 结果与讨论

2.1 当归药材及其挥发油的体相红外光谱分析

图1所示为甘肃漳县、岷县和渭源县所产3个当归药材样品的体相红外光谱。3个当归药材的红外光谱特征比较一致，主要包括：3600～3000 cm-1区域的羟基O-H伸缩振动吸收峰、3000～2800 cm-1区域的C-H伸缩振动吸收峰、1750 cm-1附近的羰基C=O伸缩振动吸收峰、1640 cm-1附近的叠加峰(蛋白质酰胺I带、羟基O-H弯曲振动吸收峰、芳环骨架振动吸收峰等)、1515 cm-1附近的芳环骨架振动吸收峰、1300～900 cm-1区域的叠加峰(C-O伸缩振动峰、O-H弯曲振动峰、糖环骨架振动峰等)[13-14]。可以看到，3600～3000 cm-1区域和1400～800 cm-1区域的当归药材红外光谱与结晶态蔗糖非常相似，说明当归药材中含有大量的结晶态蔗糖。由于蔗糖和其他成分吸收信号的叠加，在当归药材的红外光谱上难以直接观察到挥发油类成分的特征吸收峰。

注：A.当归样品1；B.当归样品2；C.当归样品3；D.蔗糖。图1 当归粉末的体相红外光谱

图2所示为甘肃漳县、岷县和渭源县所产3个当归药材样品挥发油的体相红外光谱。3个当归药材挥发油的红外光谱特征比较一致，主要包括：3100～2800 cm-1区域的C-H伸缩振动吸收峰、1760 cm-1附近的羰基C=O伸缩振动吸收峰、1700～1550 cm-1区域的双键C=C伸缩振动吸收峰、1515 cm-1附近的芳环骨架振动吸收峰、1500～1350 cm-1区域的C-H弯曲振动吸收峰、1300～900 cm-1区域的叠加峰(C-O伸缩振动峰、O-H弯曲振动峰等)[13-14]。可以看到，当归药材挥发油的红外光谱特征与藁本内酯非常相似，说明当归药材挥发油中含有大量的藁本内酯[15]。另外，1515 cm-1附近的芳环骨架振动吸收峰说明当归药材挥发油中含有一些芳香类成分，与藁本内酯不同。

注：A.当归样品1挥发油；B.当归样品2挥发油；C.当归样品3挥发油；D.藁本内酯。图2 当归挥发油的体相红外光谱

像素1的光谱信号中包含1757 cm-1等挥发油的特征峰，说明该类像素可能对应于油室碎片。像素2的光谱信号与淀粉基本一致，说明其对应于淀粉粒。像素3的光谱信号与蔗糖基本一致，这些蔗糖可能存在于薄壁细胞中。像素4的光谱信号中包含1624 cm-1和1308 cm-1处的草酸钙特征峰，说明该类像素可能对应于草酸钙晶体。像素5的光谱信号比较复杂，2921、2852、1738 cm-1等吸收峰可能来自角质层，1513 cm-1处是芳香类成分吸收峰，该类像素可能对应于细胞壁类结构，但是难以确定是哪种类型的细胞。

2.2 当归药材粉末显微红外光谱成像的非靶向分析

当归药材粉末的体相红外光谱反映的是所有化学成分的整体吸收信号，因此难以直接观察到一些特定的结构或成分特征吸收信号。当归药材粉末具有多种微观结构，也就是说其化学成分的空间分布是不均匀的。通过显微红外光谱成像技术对当归药材粉末的大量微区(每个微区称为一个像素)进行测试，使用一定的化学计量学方法对光谱数据进行解析，可以获得某些特定成分光谱信号及其空间分布信息，了解特定显微结构的化学组成。图3所示漳县所产当归样品粉末的ATR-FTIR显微光谱成像主成分分析结果，是根据不同像素显微红外光谱前3个主成分得分而生成的赝彩色图像。具有相似光谱特征的像素在不同主成分上的得分接近，因而在赝彩色图像上具有相似的颜色。从图3中可以看出，当归药材粉末中存在多种类型的像素，一些代表性的像素光谱(其空间位置标注在图3中)如图4所示。

图3 当归样品1粉末ATR-FTIR显微光谱成像主成分分析结果

图4 当归样品1粉末ATR-FTIR显微光谱成像典型像素光谱

2.3 当归药材粉末显微红外光谱成像的靶向检测

根据前面的结果分析可知，当归药材粉末的显微红外光谱图像中包含挥发油、淀粉、蔗糖、草酸钙和细胞壁等几类微观结构。因此，可以使用靶向检测的方法，在当归药材粉末中定向寻找这些显微光谱特征。从图4显示的像素光谱可知，单个像素光谱通常不能等同于单一化学成分，总是或多或少存在其他成分的干扰信号。因此，在当归药材粉末中靶向检测特征显微光谱信号时，需要使用对未知背景信号具有较强抗干扰能力的算法。本研究使用偏最小二乘投影法[16]，在当归药材粉末的显微红外光谱图像中寻找挥发油、淀粉、蔗糖和草酸钙的特征信号较强的像素。不同类型细胞的细胞壁成分具有差异，在尚未确定特定类型细胞壁特征吸收信号的状态下，本研究暂不将细胞壁作为目标检测信号之一。

图5所示为甘肃漳县、岷县和渭源县所产3个当归药材粉末ATR-FTIR显微光谱成像的特征信号靶向检测结果，是目标光谱投影值最高的像素光谱。3个样品中均能顺利找出具有挥发油、淀粉、蔗糖和草酸钙特征吸收信号的像素光谱，说明这些光谱信号作为当归药材粉末的显微红外光谱鉴定特征是可行的。

注：A1～A4.当归样品1；B1～B4.当归样品2；C1～C4.当归样品3。图5 当归粉末ATR-FTIR显微光谱特征靶向检测结果

3 结论

红外光谱用于中药质量评价的根本优势在于直接无损，样品不需要进行分离提取或衍生化等分子标记处理，可以显著地节省检测过程的人力、物力、时间、化学品消耗。但是，中药样品不经分离而直接进行红外光谱测试时，样品中各种成分的吸收信号叠加在一起，弱吸收信号被强吸收信号所掩盖，难以找出微量成分的特征信号。本研究的结果说明，使用显微红外光谱成像技术对中药粉末进行表征，可以将显微物理结构与显微化学成分相结合，以物理分离代替化学分离而实现微量成分信息的挖掘。

根据中药粉末显微结构的化学特征对其进行识别，可以作为形态特征识别的补充方法，提高显微鉴别法的客观性和准确性。使用ATR-FTIR显微光谱成像技术检测其中的挥发油、淀粉、蔗糖和草酸钙特征吸收信号，可以作为当归药材粉末的光谱显微鉴别特征，为当归的质量控制提供一种有效的检测方法。