HS-GC-MS分析不同影响因素对砂仁挥发油主要成分的影响△

李婧琳，王媚，邰佳，齐菲，邹俊波，张小飞，崔春利，张琴，史亚军

(陕西中医药大学/陕西省中医药管理局中药制药工程重点学科/陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 咸阳 712046)

中药挥发油是中药中一类重要的活性物质，现代药理研究表明，挥发油具有杀虫、抑菌、消炎、抗肿瘤等作用，在中药研究中具有重要的地位[1]。但挥发油稳定性差，在制备与储存过程中易受到外界环境的影响而挥散、氧化、变质等，影响制剂的安全性及有效性[2]，现今对复方中挥发油质量控制也未见报道。为提高挥发性成分保留量，改善制剂品质，现有的处理方式是将挥发油经环糊精包和、微囊化等处理后加入复方中[3]，这样虽然能提高相关挥发油含量，但不适合工业大生产，且包合物质量不易控制[4]、在制备过程中不可避免会剔除一些成分，打破了原有配伍间可能存在的相互作用。

砂仁为姜科植物阳春砂AmomumvillosumLour.、绿壳砂AmomumvillosumLour.var.xanthioidesT.L.Wu et Eenjen 或海南砂AmomumlongiligulareT.L.Wu 的干燥成熟果实[5]。其主要成分为挥发油，阳春砂挥发性成分中乙酸龙脑酯含量最高，樟脑次之，而绿壳砂中樟脑含量最高，乙酸龙脑酯次之[6]。砂仁在中医治疗胃病中有着非常明确的药用价值，现代药理研究表明，砂仁还具有降脂、降血糖、镇痛、消炎、止泻等作用，其中樟脑、乙酸龙脑酯等成分与砂仁镇痛药效有较高的关联度[7]，这可能是砂仁行气止痛、温脾止泻的物质基础。2015版《中华人民共和国药典》中，有62味成方制剂中含有砂仁，以细粉形式入药的占85%，因挥发性成分含量的高低会直接影响砂仁的药效，进一步影响到药物间相互作用关系，故研究常见环境对砂仁挥发性成分的影响十分必要。本实验采用自动顶空进样-气质联用分析通过施加温度、光照、湿度因素[8]，模拟常见储藏条件变化对砂仁细粉中挥发性成分的影响。

1 仪器与试药

1.1 仪器

QE-300高速万能粉碎机(浙江屹立工贸有限公司)；DHG-9140电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)；7890B-5975C气相质谱联用仪，7697A自动顶空进样器(美国Agilent公司)。

1.2 试药

砂仁购自陕西兴盛德药业有限责任公司，由陕西中医药大学胡本详教授鉴定为阳春砂正品。

2 方法与结果

2.1 样品处理

取适量干燥砂仁饮片至粉碎机中粉碎，过6号筛，-20 ℃避光放置备用。

2.2 HS-GC-MS条件

顶空进样器参数：加热箱90 ℃、定量环100 ℃、传输线110 ℃，平衡时间20 min，样品持续时间1 min，GC循环时间50 min。

GC参数：HP-5M色谱柱，加热器230 ℃，分流比为5∶1，程序升温：初始温度50 ℃，保留3 min；以6 ℃·min-1升至100 ℃，保留2 min；以6 ℃·min-1升至140 ℃，保留2 min；以4 ℃·min-1升至185 ℃，保留3 min；以30 ℃·min-1升至230 ℃，保留2 min。

质谱参数：电离模式，电子轰击离子源70 eV，离子源温度280 ℃，扫描范围m/z 35～500。

2.3 储存条件

取砂仁细粉2.5 g，置于玻璃透明的扁平称量瓶中，以加热、光照(1000 lx±500 lx)、湿度(90%)为影响因素，按照表1条件进行48 h干预。

表1 干预条件

注：“—”表示不给予相应处理。

2.4 样品检测

精密称取“2.3”项下的砂仁细粉0.5 g，置于20 mL顶空进样瓶中，在“2.4”项条件下进行检测。

2.5 数据处理

根据NIST14.0库与相关文献对检出峰进行检索，并通过面积归一化法确定各组分峰相对含量，对相对含量在1%以上的挥发性成分用SPSS软件进行主成分分析及汇总，采用Rstudio软件将数据热图处理并进行聚类分析。

2.6 主成分分析

通过检索NIST14.0数据库，结合相关文献，共鉴定了72个化合物，以烯烃类为主，其中乙酸龙脑酯、樟脑、d-柠檬烯、β-石竹烯、崁烯、β-蒎烯、月桂烯、冰片等成分含量皆不小于1%，通关对相关成分进行主成分分析，最终得到2个主成分，第一主成分乙酸龙脑酯对方差贡献率为89.075%，第二类主成分樟脑方差贡献为6.028%，两者累计贡献率达到95.102%。各干预条件下测得总离子流图如图1所示。

注：A～H为表1中的干预条件；I为-20 ℃的保存条件。图1 各干预条件下测得总离子流图

2.7 影响砂仁挥发性成分稳定性因素

挥发油在储存过程中会受到温度、湿度、光照等因素影响而品质改变。对相对含量较高的24种成分进行汇总，相对变化如表2、图2所示。因低温避光环境对挥发油成分影响较小，故以-20 ℃各成分相对含量作为参照，对其他8种干预条件进行热图分析，如图2所示。其中化合物可聚为3类，分别为乙酸龙脑酯、樟脑和其他类，说明两者为主要成分，与上述主成分分析结果一致。影响因素聚为2类，分别为40 ℃、90%湿度综合影响与其他类。

注：W代表高湿；L代表光照；D代表避光；A代表干燥；“—”表示未检测到。

注：A～H为表1中的干预条件；I为-20 ℃的保存条件。图2 不同影响因素下挥发性成分变化热图

升高温度，对单萜烯烃、含氧类烯烃影响较大，如d-柠檬烯、β-石竹烯、冰片、芳樟醇、乙酸龙脑酯等化合物相对含量皆有所降低；当给予光照时，多烯类成分含量变化较为显著，如白菖烯、α-律草烯、α-水芹烯、榄香烯等相对含量皆有不同程度降低；增加湿度，芳樟醇、α-水芹烯、樟脑含量降低，而反式-橙花叔醇、桉油烯醇、β-倍半水芹烯无明显变化。

同时施加3种干预条件(光照、90%湿度、40 ℃)，能显著降低砂仁中挥发性成分的含量，其效果强于单因素单独作用，如乙酸龙脑酯、樟脑、桧烯、冰片、d-柠檬烯、芳樟醇含量分别降低了79.0%、78.2%、60.5%、87.5%、100%；单独给予光照时，对多烯类成分有较大的影响，而在高温高湿联合干预下，光照对其含量变化无显著性影响；高温和光照联合干预，能加速柠檬烯含量的降低，对樟脑等含氧烯萜化合物则起到延缓降低的作用；高湿对大多数化合物含量无显著影响，但与温度或光照联合作用，能显著降低大多数化合物相对含量。

2.8 主要成分受环境干预影响分析

以I(-20 ℃)因素下各化合物相对含量为基准，对各干预条件下4种主要成分含量变化进行分析，如图3所示。图中可以明显看出，温度、湿度、光照单独或联合作用，对d-柠檬烯、乙酸龙脑酯含量有不同程度的降低。乙酸龙脑酯在E(40 ℃、光照、90%适度)环境下含量降低最为显著，d-柠檬烯在G(40 ℃、90%湿度、避光)、E(40 ℃、90%湿度、光照)环境下含量变化明显，说明温度、湿度联合作用对d-柠檬烯含量影响大，此时，光照对其已无显著性的影响。含氧烯樟脑在B、C环境下成正向变化，说明在室温干燥环境下对含氧烯萜化合物起到延缓衰减的效果。β-石竹烯除在3种因素联合作用下含量降低，其余环境下皆成正向变化，说明β-石竹烯在一般环境下较为稳定。

注：纵向分布为表1中的干预条件；横向为各化合物较对照组含量增减程度。图3 4种主要成分在干预条件下的含量变化

3 讨论

本实验模拟砂仁在大多数处方中以原药粉入药的状态，未对砂仁挥发油进行提取，而采用HS-GC-MS，在不破坏药材油细胞的前提下，依靠升温孵化，提取挥发性成分，分析砂仁细粉在温度、湿度、光照单独或综合干预下对相关化合物含量的影响，尽可能还原砂仁挥发性成分在处方中的变化情况，为药材的储存、提取挥发油的前期研究及后期制剂设计提供依据。

实验采用面积归一化法测得各成分峰面积占总峰面积的量[9]，结果表明，砂仁中的挥发性成分以烯萜类为主，除大量共有成分外，8种干预条件测试下都能检索到少量的新的成分，但因含量过小，故未给予比较分析。这些成分是因环境改变导致成分氧化或分解产生，还是由于外界携带产生，后期会加大样品量，对新化合物的产生做进一步分析。

高温、光照因素提供了足够的反应条件及能量、高湿因素创造了充足的氧环境、3种因素联合干预下，砂仁的品质急剧恶化，应及时存放在低温(0 ℃下)、干燥(湿度<40%)、避光的环境下以达到更好的使用效果。实验结果表明，砂仁可短期放在室温干燥的条件下，可能是由于挥发油在细胞内，受各种膜及纤维的保护，削弱了外环境的干扰。利用这一特点，高波[10]等导入“药辅合一”的思想，将含有挥发油的药材直接粉碎，而未进行提取包合处理，相当于挥发油在细胞中受细胞壁保护，抑制了挥发，增强了稳定性。张定堃等[11]在“药辅合一”思想下，借鉴粒子设计技术，通过微观层面的设计，成功制备了“壳—核”包覆结构的改性口腔溃疡散，将易挥散的冰片包裹在内，提高了制剂品质。粒子设计技术是指在具有亚微观尺寸的粒子空间上对材料进行设计、研究、制造，以期亚微观粒子本身及由它构成的材料具有更好的性能、功能乃至智能，现广泛应用于化工、医疗、建筑等行业。中药粒子设计技术是通过调控入药粉末粒径，加入时间及加入顺序等，使得药物粉体间相互分散、包裹而形成特定的结构与功能[12]，以改善制剂品质。本实验也是考查不同影响因素对砂仁挥发性成分影响，以期对后期课题借鉴粒子设计的手段对复方丸、散剂制备工艺进行调整，分析挥发性成分经新工艺处理后的变化，为挥发性物质在制剂中的保留率及稳定性提供依据。