Klotho蛋白在糖尿病肾病中的研究进展

王岚，邹新蓉，王小琴

(1.湖北中医药大学第一临床学院，武汉 430061；2.湖北省中医院，湖北省中医药研究院)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病最严重的微血管并发症之一，也是终末期肾衰竭的主要致病因素。据预测，至2030年，全球范围内20～79岁的人口中将有7.7%罹患糖尿病[1]，与之伴随的，将是DN发病率的逐年上升。糖尿病肾病是多因素作用下的一种复杂疾病，其确切发病机制尚未阐明。其中，氧化应激、血管钙化、内皮功能紊乱、肾脏纤维化等是加剧DN发生发展的重要病理基础。Klotho作为一种抗衰老基因于1997年首次发现[2]，全长约50 kb，由5个外显子和4个内含子组成。Klotho主要在远端肾小管及脑脉络丛表达，少量表达于甲状旁腺、前列腺、胎盘等组织。迄今为止，发现Klotho家族包含α-Klotho，β-Klotho及γ-klotho三种蛋白。Klotho基因编码的蛋白具有抗炎性反应、抗氧化应激、抗细胞凋亡、抗纤维化、抗肿瘤等多种生物学效应。近年来相继有研究报道，Klotho在多种急、慢性肾脏疾病如急性肾损伤、缺血性肾病、高血压肾损害、多囊肾、肾小球肾炎、糖尿病肾病中发挥肾脏保护作用[3-7]，其中，Klotho 与糖尿病肾病的发生发展关系密切，业已成为研究的热点，现综述如下。

1 Klotho蛋白与糖尿病肾病氧化应激

氧化应激是孕育糖尿病微血管并发症的共同土壤，亦是激活DN相关信号通路的关键介质之一。在高糖刺激下，增强的氧化应激不仅能诱导足细胞和内皮细胞的凋亡，还能直接发起攻击，导致细胞损伤[8-9]。同时，氧化应激是活性氧(ROS)与抗氧化剂之间平衡被打破时的表现，而糖尿病是一类以ROS生成过多为特征的疾病，并由此导致三磷酸腺苷(ATP)高表达及腺呤能受体P2X7的激活，从而引发细胞死亡[10]。Menzies等[11]研究发现，糖尿病患者相较于对照组，肾组织标本中的P2X7表达增多；并通过动物实验证明P2X7抑制剂能够减轻DN小鼠的肾脏损害。可见，在高血糖刺激下，肾脏P2X7的激活参与了DN进程。而近来有研究表明，在糖尿病大鼠模型中，肾脏Klotho的表达于P2X7呈负相关，且随着病情的加剧，肾功能及氧化还原平衡参数出现改变时，仍维持负相关。因此，Klotho与P2X7在DN进程中存在拮抗作用锰超氧化物歧化酶(MnSOD)可以清除体内有害的氧自由基，具有抗氧化的作用。有研究报道：叉头转录因子O3a(FoxO3a)具有提高MnSOD表达的生物学效应[12]，因此FoxO3a可对线粒体ROS的生成起到负调控的作用，从而拮抗氧化应激[13]。Lim等[14]研究表明，Klotho能够抑制FoxO3a的磷酸化，使得FoxO3a与MnSOD启动子区域结合增强，揭示Klotho可能通过FoxO3a介导的MnSOD抑制ROS相关的氧化应激。Liu等[15]在体外实验中观察到AGEs可呈剂量依赖性的增强氧化应激并降低近端小管上皮细胞Klotho的表达；成功质粒转染后，Klotho的过表达可显著改善AGEs诱导的小管损伤标志物的产生及细胞凋亡。提示Klotho可能通过抗氧化应激发挥小管间质的保护作用。

由此可见，Klotho可通过阻断P2X7，调节FoxO3a、AGEs因子等多种途径抗氧化应激，发挥肾脏保护作用。

2 Klotho蛋白与糖尿病肾病血管钙化

血管钙化是高血压、糖尿病、慢性肾脏病、动脉粥样硬化等多种疾病普遍存在的病理特点。既与钙磷代谢紊乱，钙盐沉积于动脉壁有关；又与骨的矿化作用类似，是一种细胞介导的可调控的过程，其中以血管平滑肌细胞(VSMC)向成骨样细胞表型转变最为常见。而DN在双重危险因素作用下，血管钙化愈发明显，导致患者致残率及死亡风险升高。Klotho基因敲除小鼠在4周龄时即可出现动脉硬化，并持续加重，表现动脉广泛钙化，而予以外源性Klotho干预后，血管病变得以明显改善[2]。Hum等[16]发现，通过腺相关病毒介导的Klotho基因转导能够降低DN小鼠的血磷水平。Jono等[17]报道，Klotho的高表达能够有效抑制高磷诱导下的VSMC向成骨细胞转分化。进一步研究发现，在尿毒症环境下，VSMC上的Ⅲ型钠磷协同转运体中的亚型Pit-1活性增强，表达升高，Pit-1可促进磷的吸收，从而引发血管钙化。而当Klotho过表达时，Pit-1水平下降，成骨细胞转录因子2表达减少；提示Klotho可能通过抑制VSMC对磷的吸收，防止VSMC向成骨细胞表型转变，从而减轻血管钙化[18]。成纤维细胞生长因子-23(FGF-23)是体内重要的调磷因子，Klotho作为FGF23与FGFR结合所必须的辅助因子，协同FGF23调节钙磷代谢。在DN患者的血浆及肾脏中，Klotho表达下降，随着病情加剧，肾脏分泌的Klotho显著减少，由此引发机体对FGF23的抵抗状态，导致血磷升高，继发性甲状旁腺功能亢进，维生素D缺乏等一系列代谢紊乱的局面，最终将导致血管钙化[19-23]。

以上证据表明，Klotho可能通过参与调节钙磷代谢，抑制VSMC向成骨细胞转分化得以防治DN血管钙化。

3 Klotho与糖尿病肾病内皮功能紊乱

血管内皮功能紊乱与DN 的发生发展密切相关。广泛的内皮损伤是糖尿病微血管并发症的重要危险因素之一。生理状态下，血管内皮生长因子(VEGF)能够调节血管通透性，促进血管新生并维持血管功能。Klotho基因缺陷小鼠表现出VEGF介导的血管生成受损及血管通透性升高[24]。近来有报道称Klotho蛋白可通过直接与VEGF受体2(VEGFR-2)及瞬时受体电位通道1(TPRC-1)相结合，增强VEGFR-2与TRPC-1之间的相互作用，从而调节VEGFR/TRPC-1介导的Ca2+内流，发挥维持血管内皮生物稳态的作用[24]。相反，Klotho缺乏将引发Ca2+内流持续增强和Ca2+依赖型蛋白酶的过度活化，促使血管损伤，血管通透性升高。可见，Klotho可能通过调节VEGF的表达参与血管病变的病理过程[25]。可调节肾小球血管壁通透性，发挥血管保护作用[26-27]。Kadoya等[28]报道，在早期糖尿病肾病Akita小鼠模型中可观察到内皮细胞糖萼缺失、肾小球巨噬细胞浸润、肾小球肥大、系膜扩张等病理特征，而在Klotho转基因-Akita小鼠模型中，Klotho的过表达使以上病理损伤得以缓解。钙蛋白酶的激活与肾小球巨噬细胞浸润关系密切。有研究表明，抑制钙蛋白酶的活性可以减少高糖环境下的内皮细胞表面促炎症黏附分子的表达[29]。而Kadoya等在细胞培养时，进一步发现，Klotho能够抑制高糖诱导下的钙蛋白酶激活。Manya等[30]在Klotho基因缺陷的小鼠肾脏中观察到μ-钙蛋白酶的激活，说明Klotho蛋白可以抑制μ-钙蛋白酶的活化。

因此，Klotho可能是一种血管保护蛋白，通过调节VEGF的表达，维持内皮的的生理结构，降低内皮细胞的炎性反应和拮抗钙蛋白酶的活性等途径，改善内皮功能，发挥DN的保护作用。

4 Klotho蛋白与糖尿病肾病肾脏纤维化

转化生长因子-β1(TGF-β1)信号通路的激活可引发DN肾脏纤维化[31]。有研究报道[32]，在Klotho基因缺陷小鼠肾脏中，TGFβ1的下游因子Smad2磷酸化水平增强，说明Klotho基因缺陷可能通过激活TGFβ1/Smad2信号通路，加剧早期DN。提示Klotho蛋白可通过拮抗TGFβ1，发挥在DN中的抗纤维化作用。目前认为，在DN状态下，Wnt/β-catenin信号通路的激活参与了足细胞功能失调，系膜细胞凋亡，小管上皮细胞间质转分化的进程，从而与DN纤维化密切相关[33]。Zhou等[34]研究表明，无论在Akita、db/db小鼠还是链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病小鼠肾组织中，均可出现Wnt、β-catenin蛋白表达上调。进一步在Akita糖尿病小鼠模型中观察到，Wnt信号通路的激活可导致多种促纤维化因子的过度生成，而予以Wnt信号通路阻断剂干预后，Akita糖尿病小鼠肾脏的纤维化、炎症状态得以显著改善。有学者在单侧输尿管梗阻及阿霉素诱导的肾脏纤维化小鼠模型中发现，β-catenin的活化与Klotho蛋白表达减少关系密切，且在体外实验中发现，Klotho能够与Wnt1、Wnt4和 Wnt7a等多种配体相结合，从而抑制Wnt信号通路的激活。证明了Klotho是Wnt/β-catenin信号通路的内源性阻断剂[35]。而在本课题组的前期研究中，同样证明了Klotho与Wnt/β-catenin的负向调控关系。在STZ诱导的DN小鼠肾组织中Klotho蛋白表达较健康对照组明显下降，Wnt、β-catenin蛋白表达显著上调；而中药治疗组DN小鼠中，Klotho蛋白表达较模型组明显增加，而Wnt、β-catenin蛋白表达水平则相反[36]。亦有学者在单侧肾切除的糖尿病小鼠中发现，经重组Klotho干预后，肾小球肥大及促纤维化指标均明显下调[37]。

以上种种证据表明，Klotho通过参与调控TGF-β1、Wnt信号通路等多种途径拮抗DN纤维化的进程，发挥肾脏的保护作用。

5 小结

现阶段临床上针对糖尿病肾病所导致的高致残率、高死亡率，尚无确切有效的治疗方案，寻找新的治疗靶点，将具有重要意义。Klotho作为一种抗衰老蛋白，可通过抗氧化应激、抑制血管钙化、调节内皮功能、拮抗肾脏纤维化等多种途径保护肾脏，有望成为糖尿病肾病新的治疗靶点。