河南省猪肺炎支原体感染的流行情况调查

徐引弟 ，张青娴 ，王治方 ，焦文强 ，李海利 ，朱文豪 ，王克领

（1.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南郑州450002；2.河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，河南郑州450002）

猪支原体肺炎（Mycoplasmal pneumonia of swine，MPS）又称猪地方流行性肺炎（swine enzootic pneumonia），俗称猪气喘病，是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae）引起的猪的一种慢性呼吸道传染病，其是猪呼吸系统的主要病原，在猪呼吸系统综合征（PRDC）中起着重要作用。MPS发病的第一阶段是猪肺炎支原体通过黏附素p97，p102和p159与呼吸道黏膜纤毛上皮细胞黏附，此外，猪肺炎支原体还能产生过氧化氢，从而导致相应部位的炎症病变，造成纤毛的停滞、聚集和脱落以及对呼吸道上皮的直接毒性伤害，最终导致细菌的清除减少，并为继发性呼吸道感染打开大门。预防和控制猪肺炎支原体一般采用优化管理方法，如全进全出、多点操作、抗菌药物和疫苗。猪肺炎支原体的无菌状态很难维持，特别是在猪密度较高的地区，因为病菌在空气中传播可能长达几千米。四环素和大环内酯类药物最常用于控制和治疗猪肺炎支原体引起的呼吸道疾病，然而，抗生素不能从呼吸道清除猪肺炎支原体，也不能恢复已经发展的肺部病变；此外，抗生素的大量使用和不合理的使用还会导致抗生素的耐药性增加，这对动物和人类健康都有重要的不利影响。商业化疫苗被广泛应用于防治猪支原体肺炎，接种疫苗可以减少临床症状和肺部病变的发生，但另一方面并不能阻止支原体对呼吸道上皮的定植[1-3]。

本研究从河南省发生呼吸道疾病的猪场的猪肺中分离鉴定猪肺炎支原体，旨在为河南省猪肺炎支原体的感染情况、流行病学及综合防制提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料与参考毒株 病料来自于2017年1—12月在河南省大中型猪场发生重症肺炎呼吸困难的猪的实变的肺脏；阳性对照为猪肺炎支原体168疫苗株，购自南京天邦生物公司。

1.1.2 主要试剂和酶 PPLO肉汤粉、脑心浸出粉、酵母粉购自Difco公司；葡萄糖购自上海国药集团公司；MEM、猪血清购自Hyclone公司；L-精氨酸、酚红购自Solarbio公司；青霉素，琼脂粉，2×PCR Mix，DL2000 Marker，Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒购自生工生物工程（上海）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基的制备

1.2.1.1 PPLO液体培养基 PPLO肉汤粉21 g，脑心浸出粉16 g，葡萄糖50 g，酵母粉5 g，溶于800 mL超纯水中，调pH值为7.6，定容至1 000 mL，115℃灭菌15 min，配成基础液；再加入MEM培养基5 mL、猪血清50 mL、青霉素8万单位、10%精氨酸10 mL和1%（m/V）酚红500 μL。培养基于115℃灭菌15 min后，于4℃保存备用。其中，青霉素、精氨酸、酚红配制为高浓度溶液后过滤除菌，后于-20℃保存。

1.2.1.2 PPLO固体培养基 其是在PPLO液体培养基中加入1.5%（m/V）琼脂粉。培养基于115℃灭菌15 min后，于4℃保存备用。

1.2.2 猪肺炎支原体的分离培养 取适量肉变的病变肺组织加入2 mL的灭菌PBS缓冲液，研磨，取上清，5 000 r/min离心10 min，取上清液0.45 μm滤膜过滤于PPLO液体培养基中，37℃5%CO2培养箱中培养；培养5～7 d后，取1 mL转接PPLO液体培养基中再次培养，传代3～5代后液体颜色由红色变为黄色，取100 μL涂布PPLO固体培养基表面，置于37℃5%CO2培养箱中培养；3～10 d后，在低倍显微镜下逐日观察固体培养基上菌落的形态。吉姆萨染色，油镜下观察菌体形态。

1.2.3 猪肺炎支原体的PCR鉴定

1.2.3.1 引物的设计 根据GenBank中猪肺炎支原体J株（GenBank No.AE017243），7488 株（Genb-ank No.AE017244），232 株 （GenBank No.AE017332），7422株（GenBank No.CP003802）16S rRNA基因序列设计1对通用引物，用于猪肺炎支原体的扩增，由上海生物工程有限公司合成，引物序列为：上游引物 P1：5′-ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTG-3′；下游引物 P2：5′-CGCGGATCCGCTACCTTGTTAC GA-3′，预计扩增目的片段1 600 bp。

1.2.3.2 猪肺炎支原体的DNA提取 用PBS液将PPLO固体培养基上的菌落洗下，离心、收集菌体，按照DNA提取试剂盒操作说明提取DNA。

1.2.3.3 PCR检测 PCR体系为 25 μL：2× PCR Mix 12.5 μL，上、下游引物各 1 μL，纯水 ddH2O 8.5 μL；待测 DNA2 μL。

PCR 扩增程序为：95℃ 4 min；95℃ 30 s，55℃30 s，72℃1 min，35个循环；最后72℃5 min。取10 μL扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。

1.2.3.4 PCR产物的回收与纯化 将阳性PCR产物回收，16℃连接PMD19-T载体过夜，转化JM109感受态细胞，涂布含AMP，x-gal，IPTG的LA平板，37℃培养过夜，挑取白斑于含AMP的LB中培养过夜，提取质粒，PCR检测，阳性质粒由生工生物工程（上海）有限公司测序，序列用Blast软件进行比对分析。

1.2.4 河南省部分猪场猪肺炎支原体的流行情况调查 2017年1—12月从河南省猪场发生呼吸困难的猪的实变的肺脏共采集148份，分离鉴定猪肺炎支原体，测序并比对。

2 结果与分析

2.1 猪肺炎支原体的分离培养

肺组织上清传代后，PPLO固体培养3～5 d后，肉眼可见极小的透明针尖状菌落；低倍显微镜下观察固体培养基上菌落的形态可知，形态有的为典型的支原体“煎荷包蛋样”，有的为圆形、隆起的不具备“煎荷包蛋样”菌落（图1）。吉姆萨染色，油镜下观察支原体菌体形态可知，其为多形态，呈球状、杆状、螺旋状、丝状，大多呈丝状（图2）。

2.2 猪肺炎支原体的PCR鉴定

将疑似猪肺炎支原体的肺组织提取DNA，进行扩增，结果扩增出与预期大小符合的片段（图3）。阳性片段回收，连接T载体，由测序、比对可知，序列与168株同源性均在95%以上。

2.3 河南省部分猪场猪肺炎支原体的流行情况调查

2017年1—12月从河南省猪场发生呼吸困难的猪的实变的肺脏共采集148份样品，共分离鉴定出25株，分离率达16.89%。PCR鉴定后测序，与疫苗株168株同源性均在95%以上，与标准株7422株 （GenBank No.CP003802），J株（GenBank No.AE017243），7488 株（GenBank No.AE017244），232株（GenBank No.AE017332）同源性均在98%以上，结果证实，所分离的均为猪肺炎支原体。表明河南省发生呼吸道疾病的猪场猪肺炎支原体的阳性率较高。

3 结论与讨论

猪肺炎支原体可在猪群中持续存在，各种年龄、品种、性别的猪都易感染。该病一年四季都可发生，冬季容易多发。病猪和隐形带毒猪是主要传染源，无临诊症状有病理变化猪，或无临诊症状无病理变化阴性带菌猪比较常见。MPS的诊断方法主要有病原的分离和鉴定、ELISA方法检测抗体、PCR、原位杂交、芯片检测等[4-13]。其中，PCR方法敏感性和特异性较好，是临床病原学诊断中较为普遍的一种方法。而病原的分离鉴定是检测病原最为准确、最有效的方法。

常规的病原鉴定通常是先分离培养，然后根据病原在固体或液体培养基上的生长情况、菌落形态、生理生化特征，进而挑菌、染色、镜检，最后PCR、测序鉴定，该方法操作复杂、所需时间长。而对于猪肺炎支原体，由于常规的PCR检测操作中，对病变肺组织进行研磨后，猪肺炎支原体的含量极少，因此，PCR方法容易出现假阴性的结果，猪肺炎支原体生长条件比较严苛，通常在液体培养基培养5～7 d才可以看到培养液颜色的变化，而且必须通过3～5代甚至6～8代的传代才能富集猪肺炎支原体，从而分离出病原菌，同时，在猪患支原体肺炎时，会同时感染猪鼻支原体和絮状支原体，后二者很容易掩盖前者，不利于猪肺炎支原体的检出。因此，将猪肺炎支原体进行培养基扩增后与PCR检测方法相结合，利用猪肺炎支原体的16S rRNA基因序列设计出特异性引物，其对于常见的猪鼻支原体、猪败血支原体、胸膜肺炎放线杆菌、沙门氏菌等其他常见病原菌则不能扩出特异片段，以此确保检测的准确性及特异性。因此，PCR方法和分离鉴定方法各有优缺点，只有PCR检测方法和分离鉴定方法相结合，才能准确地检测出病原[7-10]。

由于猪肺炎支原体的生长条件苛刻，培养基成分十分复杂，配制非常繁琐，培养时间长，因此，选择合适的培养基，提高培养基的营养，缩短培养时间，是提高分离效率的关键。本试验选择了PPLO加酵母粉、脑心浸粉、MEM、葡萄糖、精氨酸、猪血清的培养基，成分相对简单，配制简单，但营养高，液体5～7 d能看到颜色明显变化，固体培养基最早3～5 d就能看见明显的菌落生长，大大提高了培养效率，缩短了培养时间，提高了分离效率[13-14]。

由于临床上抗生素的大量使用，使得猪肺炎支原体的耐药性十分严重，从我们采集的病料来看，大多是使用过大量抗生素治疗的，部分是使用过疫苗的，但效果仍然不明显，或者容易反复，临床症状和肺部病变仍然典型，部分仍然能分离出猪肺炎支原体。因此，科学合理使用抗生素和疫苗是防控猪支原体肺炎的关键[15]。

本研究结合猪肺炎支原体的PCR方法和分离鉴定方法，通过对河南省猪场的患呼吸道疾病的猪进行猪肺炎支原体的分离鉴定，分离率高达16%以上。表明猪肺炎支原体在患呼吸道疾病的猪群中感染率较高，是危害猪场较为普遍、严重的病原。研究结果可为河南省猪肺炎支原体的病原流行病学研究、疫苗的研究及综合防制提供一定的依据。