发酵环境变化对酵母生长和成品啤酒的影响

崔云前，吴梓萌，苏文超，张海梦

（齐鲁工业大学 生物工程学院 山东省微生物工程重点实验室，山东 济南 250353）

啤酒是人类古老的酒精饮料，历史悠久，随着科学技术的提高以及人们对啤酒工艺的不断探求，酿酒师们已经掌握了啤酒发酵过程的生化机理，但酵母代谢过程复杂并且发酵过程中可以改变的工艺参数众多，如麦汁浓度、发酵温度设置、压力参数等。啤酒发酵过程中采取的酿造工艺将直接或间接影响到成品啤酒中的高级醇、酯、双乙酰等风味物质。所以了解啤酒发酵过程中的变量因素，优化酵母的生长环境，可以有效控制发酵进程，本文选取了几个主要的变量因素，对现有的研究进行了综述，以期为啤酒工业生产提供理论参考。

1 麦汁浓度

麦汁营养成分丰富，为酵母细胞提供了良好的生存环境，糖类物质约占麦汁浸出物的90%，酵母利用麦汁中的可发酵糖产生代谢产物乙醇和二氧化碳，同时形成一系列发酵副产物，如醇类、醛类、酯类、酮类和硫化物等物质[1]。酵母进行有氧呼吸，麦汁中糖度快速下降，酵母生长繁殖结束后，糖度下降趋势呈现平稳状态，有研究发现[2]，初始糖度12°P的麦汁，啤酒主发酵周期为4～6 d，发酵完成后的小麦主发酵液糖度值为4～5°P。

1.1 渗透压力

当酵母接种到一定浓度的麦汁后，会受到渗透压力，渗透压是在由半透膜隔开两种浓度不同的溶质时产生的力。酵母细胞可以根据渗透压力改变自身体积的大小，在高渗环境下，减少细胞体积；在低渗环境下，增加细胞体积。PRATT P L等[3]将酵母暴露于20 g/100 mL的山梨糖醇溶液15 min后，利用扫描电子显微镜进行观察，与对照组表面光滑的酵母细胞相比，处理过的酵母细胞发生收缩，存在外包膜的褶皱和内陷，同时发现爱尔菌株酿酒酵母（Sac charomyces cerevisiae）、比拉格菌株巴斯德酵母（Saccha romyces pastorianus）对渗透胁迫的耐受性更大。ZHUANG S W等[4]提出，随着麦汁浓度增加，酵母细胞膜流动性受到影响，为了应对渗透压力的改变，会产生丙三醇和海藻糖，保护细胞内可溶性酶并且对细胞膜稳定性起作用。

麦汁渗透压随着稀释原麦汁浓度而降低，但乙醇和丙三醇的渗透压在较高浓度下会增加，因此乙醇是发酵过程中影响渗透压的主要因素。

1.2 乙醇胁迫

以初始糖度为18°P的麦汁为典型，得到的成品啤酒中含7.5%vol的酒精。先前的研究表明[5]，应用高浓度酿造技术酿造传统的浑浊啤酒（opaque beer）时，啤酒中的酒精浓度为4.74%vol，与标准发酵条件下记录的产酒精浓度相比，高出了2.66%vol。根据ERTEN H等[6]的研究，利用高浓度麦汁进行酿造时，每单位的可发酵浸出物产生更多的乙醇，这个工艺需要使用无氧水进行下游稀释步骤来调节成品啤酒中浸出物/乙醇的含量[7]。

因此，使用高浓度麦汁进行酿造时，应定期监控乙醇含量[8]，乙醇含量较高，应相应地补充发酵液营养条件，如金属离子（锌、镁、钙）、脂质和酵母营养[9]。

1.3 麦汁浓度对酵母生长和成品啤酒的影响及解决措施

在过去50年左右的时间里，提高酿造和蒸馏的效率已经成为酿造和蒸馏行业的一个主要焦点[8]。可以提高生产效率的高浓酿造顺势而生，高浓度酿造是利用高于标准浓度的麦汁进行酿造，为了增强啤酒的稳定性，后期用去氧水对啤酒进行稀释处理[10]。通过这种方式，提高了生产需求，节省能源，而不会从根本上扩大酿造、发酵和贮存设备，啤酒口味更加顺滑[6]。

JANE M M等[11]选取12～20°P的麦汁进行啤酒酿造，发现与正常浓度的麦汁（12°P）相比，发酵96 h后，高浓度酿造时的残余可溶性固形物含量较高，会导致啤酒中有不可接受的甜味。高浓度酿造啤酒仍然存在的问题是啤酒泡沫稳定性不好，STEWART G G[12]对20°P与10°P麦汁进行研究，从满锅麦汁到成品啤酒，监测其中的疏水性多肽，发现高浓度麦汁（20°P）在发酵过程中大量损失疏水性多肽，发酵结束只有50 mg/L，将高浓度酿造得到的啤酒稀释至酒精含量4.5%vol，疏水性多肽含量不到低浓度啤酒（10°P）的50%。

高浓度麦汁酿造时产生的酯类含量更高，主要为乙酸乙酯和乙酸异戊酯，这与LIMA L等[7，13-14]的研究结果一致，啤酒中的果香和丁香花味更突出。利用高浓度麦汁进行酿造时，采取分批通风，接种酵母时增加麦汁中的溶解氧含量，促进了酵母生长，一定程度上降低了酯含量[15]。发酵温度也可以加速高浓度发酵，LIMA L等[7]通过试验证实温度增加至18 ℃，酵母接种率增加至22×106CFU/mL，可以使22°P和15°P的麦汁发酵时间相同。STEWART G G[8]提出，当酵母接种到高浓度麦汁（＞16°P）后，利用亚甲基蓝染液对酵母细胞进行活力鉴定，发现酵母细胞活力下降，这与ZHUANG S W等[4]的研究结果一致。酵母长期处于高浓度乙醇、CO2和不同浓度渗透压的环境中，对酵母有毒害作用[16]，使酵母的生长代谢受到抑制，酵母使用代数明显降低，这与PRATT P L等[3，17]的研究结果一致。高浓酿造中补充8种氨基酸（蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸）可以显著提高麦汁发酵度，促进酵母生长[18]。

此外，麦汁浓度是影响发酵度的关键因素，发酵度是酵母消耗麦汁中浸出物的量与原麦汁浸出物总量的比值。酿造高发酵度（70%以上）的啤酒时，麦汁浓度越低，乙醇生成量减少，感官品评后发现啤酒口味越寡淡，风味物质生成量减少[19]。在现代啤酒厂，通过发酵高浓度麦汁来缩短发酵时间并且增加产量，麦汁浓度高低对酵母吸收营养物质并进行生长代谢都具有重要影响[20]。

2 接种率对酵母生长和成品啤酒的影响

酵母接种率对发酵速度影响极大，需根据酵母种类、麦汁浓度、发酵温度等因素来确定，以添加酵母后使麦汁快速起发为准[15]。传统啤酒厂发酵时正常酵母接种率为20×106CFU/mL。

VERBELEN P J等[21]在实验室条件下将拉格菌株接种到15°P麦汁中，发现2～3代酵母发酵时，将酵母接种率增加4倍可以缩短发酵时间，这是因为高接种率比起正常接种率的细胞，初始阶段细胞密度高所以对发酵环境的适应能力较强，发酵时间缩短[22]。增加接种率，发酵旺盛，酵母吸收氨基酸能力增强，形成有机酸和CO2以及酵母细胞分泌H+多，得到的成品啤酒中pH较低[22]。

RODMAN A D等[23]对啤酒酿造过程进行动态仿真与可视化分析，发现接种率较低会引起发酵副产物双乙酰和乙酸乙酯浓度较高，VERBELEN P J等[22]提出，随着发酵进行，任何酵母接种率下检测到的双乙酰含量都是升高的，当可发酵糖消耗50%以后，接种率为1×107～2×107CFU/mL时，检测到双乙酰含量开始下降，但接种率为4×107～12×107CFU/mL时，产生双乙酰一直在增多，仅在糖消耗70%～80%后才呈现下降趋势。酵母发酵2代后，接种率正常的酵母细胞，啤酒中双乙酰维持在稳定值（0.26 mg/L），接种率高，啤酒中双乙酰含量比较高，但对酵母进行充氧，可有效减少啤酒中双乙酰含量[21]。KUCHARCZYK K等[14]提出接种量（5×106～7×106CFU/mL）较低时，改变酵母接种率对整个工艺中乙醛的平均含量没有显著的统计学影响，当麦汁中酵母接种量从7×106CFU/mL增加至9×106CFU/mL，乙醛浓度发生了可比较的降低，VERBELEN P J等[22]也证实了这个结论。对于1代酵母，接种率高产生的高级醇含量较多，主要是异丁醇和异戊醇浓度增加，而随着酵母使用代数增加，接种率高低产生高级醇含量差异不明显[21]。酵母接种率不同，细胞净生长量（最多酵母细胞数与最初接种率的差值）不同，但乙醇产量是相同的，这与RODMAN A D等[23]的研究一致，但刘丽艳[24]研究提出，接种率较高乙醇产生较多。VERBELEN P J等[21]提出与正常酵母接种率相比，接种率提高4倍对乙酸乙酯、乙酸异戊酯和己酸乙酯有消极影响。乙酸异戊酯在接种率为40×106CFU/mL时有最大生成量，己酸乙酯没有明显产量趋势[22]。酵母接种率从5×106CFU/mL增加至7×106CFU/mL乙酸乙酯的生成量没有改变，但是接种量进一步增加，从7×106CFU/mL增加至9×106CFU/mL，酯浓度显著增加了10%[14]。

发酵结束时，发现较高接种率（20×106～120×106CFU/mL）比起较低接种率（10×106CFU/mL），酵母细胞活力显著下降，表明发酵时间较长对细胞活力有消极影响[22]，VERBELEN P J等[21]的研究也证实了这个观点。

在高接种率发酵时，酵母细胞的净生长量下降，对接下来几代酵母的生理学稳定性有不利影响。因此，需要应用不同的O2条件，如麦汁充氧和对发酵液充氧，这对酵母生理和高细胞密度发酵下啤酒风味物质的稳定至关重要。

3 发酵温度对酵母生长和成品啤酒的影响

发酵过程的温度会严重影响酵母生长和代谢速率，随着发酵开始，需要随时监控发酵罐内的温度，在加速发酵的同时确保酵母特性没有改变并且发酵副产物的产量不会损害成品啤酒的风味。麦汁开始发酵之前，需要保证满罐温度和发酵开始的温度一致，一般麦汁的满罐温度比主发酵温度低3～4 ℃[25]。

拉格菌株发酵温度在6～15 ℃，发酵时间大约在一周（160 h）；爱尔菌株发酵温度较高在18～25 ℃，发酵时间较短为3～4 d。比起拉格菌株，爱尔菌株的代谢状态对温度变化更敏感，一般发酵温度较高会加快麦汁中可发酵糖的消耗率，游离氨基氮含量会增多，促进酵母细胞生长和增殖，减少发酵时间并增加啤酒生产效率；温度较低可以防止细菌污染并赋予啤酒独特的口感和香气，但会导致酵母发酵活力降低[26]。为了应对发酵温度的变化，酵母细胞会快速地调整自身的代谢状态[27]，改变酵母生长率、发酵速率并形成代谢物。RODMAN A D等[23]提出，发酵过程中的温度会严重影响酵母生长和代谢速率，只要发酵环境维持在30 ℃以下并且酵母细胞不受损害，温度越高发酵速度越快。超过这个临界温度，酒精和挥发性风味物质严重损失，同时产生不受欢迎的物质，细菌生长增加。

当原麦汁浓度相同时，主发酵温度对发酵速度影响较大，主发酵温度越高，发酵速度越快[28]。YU Z M等[26]的研究发现，发酵温度从15 ℃变化至10 ℃时，拉格菌株和爱尔菌株的发酵时间分别延长了33.33%和100%，发酵温度较低，葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖等糖代谢活力降低，糖酵解关键酶如己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的最大反应速率下降，酵母细胞生长和增殖变得迟缓。提高发酵温度，酵母生长繁殖加快，高级醇生成增加，特别是芳香醇，如β-苯乙醇、酪醇、色醇[15]。高温发酵对酯形成有利，当发酵温度从12.5 ℃升至25 ℃，乙酸乙酯浓度增加了60%，乙酸异戊酯增加30%[15]。发酵温度为17～22 ℃，20 ℃时啤酒稳定性和品质较好[24]，WEBERSINKE F等[29]也提出，在20 ℃进行发酵时，水果香气、酒精、酸度和酒体呈现最佳值，硫味和腐败味最淡。

在发酵过程中要保证麦汁发酵温度始终如一，只有稳定的发酵温度才能确保酵母生长和发酵速度一致。

4 压力对酵母生长和成品啤酒的影响

在啤酒酿造过程中，酵母菌株悬浮在发酵液中进行发酵活动，在发酵结束后，酵母菌株遵循自身独特的酿造特性，拉格菌株絮凝物沉积到锥形发酵罐锥底[30]，从锥底排出酵母进行回收；爱尔菌株的絮凝物与CO2结合上升到啤酒表面[31]，国外的发酵罐多为敞口发酵罐，可在啤酒表面进行回收，但国内发酵罐多为封闭式发酵罐，回收爱尔菌株时多在降温后絮凝物沉积到锥底进行回收。在啤酒工业生产中，啤酒发酵罐的体积较大，加上液位压差和发酵过程产生的CO2，同一发酵罐中不同部位的酵母受到的压力不同。对于大型发酵罐来说，罐内压力有时可达0.3 MPa[32]。

一般来说，最高控制罐压为发酵温度除以100，罐压越高，啤酒中溶解CO2越多。在发酵过程中，增加麦汁高度会加大静止液压，CO2浓度增加，酵母生长繁殖受到影响，发酵速率降低，压力上升也会抑制酯和高级醇的生成，所以保持一定高度的麦汁很有必要[25]。对比常压（0.1 MPa）培养的酵母，加压培养（0.3 MPa、0.5 MPa、1.0 MPa）酵母到达对数生长期的时间推后，持续时间会缩短，并且衰亡期会提前到来，酵母产二甲基硫的能力下降，双乙酰合成和还原都受到影响[32]，啤酒中绝大多数的挥发酯和高级醇都是在主发酵期间形成，乙醛作为乙醇的前体物质，在主发酵前期大量产生[15]，酵母细胞受到一定压力，细胞内各种酶活力会下降，抑制酯类物质和高级醇的代谢，挥发酯和高级醇生成量会减少，乙醇脱氢酶活力下降造成乙醛不能被还原为乙醇[33]，成品啤酒中乙醛含量超过阈值。另有研究[34]指出，保持一定压力发酵对酵母增殖有积极作用，可以降低发酵液中蛋白酶A含量，从而减少啤酒中泡沫活性蛋白的降解，可以促进啤酒维持一定的泡持性。

发酵过程中产生的压力会影响酵母的正常代谢活动，酶代谢能力下降，影响挥发性风物物质的生成和还原，最终影响成品啤酒的风味。但是，随着人们追求生产效率，发酵设备逐渐变得大型化，压力将是人们不可忽视的影响因素之一。

5 结论

在实际生产酿造中，应不断调整工艺，根据啤酒厂定义的产品目标，对存在的问题进行有效控制，可以通过牺牲低优先级的工艺目的提高发酵效率，如适当提高发酵温度，在缩短发酵时间的同时却适度降低了乙醇含量和乙酸乙酯浓度，并在可容许范围内增加了双乙酰浓度[35]；随着麦汁浓度的增加，有必要成比例地增加酵母接种率[10]并优化温度条件；发酵罐罐压会影响酵母的状态和活力，外观发酵度70%以上，适当增加发酵罐罐压（0.10 MPa升至0.14 MPa），双乙酰还原加快[36]。此外，也应该根据啤酒自身发酵特点选育合适的酵母。