中国白酒风味成分的色谱分析方法研究进展

熊燕飞，马 卓，彭远松，颜 禹，雷翔云，冯华芳，敖宗华，丁海龙*

（1.泸州老窖股份有限公司，四川 泸州 646000；2.国家固态酿造工程技术研究中心，四川 泸州 646000）

中国白酒是世界六大蒸馏酒之一，是中华民族智慧的结晶。中国白酒由于香型的不同，其酿造工艺也纷繁复杂，而曲药天然微生物接种、固态糖化发酵、固态甑桶蒸馏等为各香型白酒共有的关键环节[1]，同时也是中国白酒区别于其他世界五大蒸馏酒的独特酿制工艺。

开放制曲和固态微生物菌群发酵两项独特的酿造工艺，以及中国白酒复杂的酿造环境，使中国白酒风味成分极其丰富。白酒风味成分种类多样、成分复杂，含量较低[2-5]，并且具有不同的挥发性、极性、溶解性、热稳定性等理化特性[1]，这对白酒风味成分检测带来了极大的困难和挑战，也对检测设备、检测方法提出了更高的要求。白酒风味成分的分析需要综合多种分析检测方法，本文对中国白酒风味成分色谱分析方法进行了综述，为科学认识中国白酒风味成分及分析方法提供参考。

1 中国白酒风味成分色谱分析方法的发展史

中国白酒独特的发酵工艺以及开放的酿造环境，使得中国白酒风味成分的多样性和独特性高于其他五大蒸馏酒。世界六大蒸馏酒中，白兰地风味成分约400种，威士忌约100种，朗姆酒约180种，伏特加、杜松子酒因其自身工艺及标准要求，风味成分低于100种[6]。LIU H等[7]研究发现，中国白酒已发现的风味成分多达1 874种，包括酸、酯、醇、醛、羰基化合物、芳香族化合物、吡嗪类化合物、萜烯类化合物、呋喃化合物、含氮化合物、含硫化合物等。白酒中成分多样、种类复杂的风味成分使定性和定量分析具有较高难度：首先，多种痕量香气物质含量仅有纳克级，很难达到检测器的检测阈值；其次，多种结构相同的风味成分具有相同或相近的保留指数，难以完全分离；最后，白酒中化合物理化性质复杂，包括易挥发成分、非挥发成分、离子态化合物、非离子态化合物，单一色谱分析方法难以窥得白酒中风味成分的全貌。

自20世纪60年代以来，多位学者在白酒风味成分方面展开研究，多种新型设备和分析方法也应用于白酒风味成分分析，使得中国白酒风味成分终于揭开神秘面纱的一角，人们对白酒的认识越来越深刻清晰。其中具有突破性的成就包括：1968年，轻工业部食品发酵工业研究所与中科院大连化物所合作采用毛细管、填充柱等色谱法分析白酒香味组分，建立了色谱分析白酒风味成分的方法，并利用该方法对茅台酒中风味成分进行分析，从中鉴定了50个组分，从而为色谱技术分析白酒风味成分奠定了基础[8]；20世纪80年代后期，蔡心尧[9]利用毛细管色谱柱气相色谱（gas chromatography，GC）分析白酒香味组分，建立了毛细管柱直接进样检测白酒风味成分的方法，该方法由于不需要萃取、衍生等复杂前处理操作，且具有高分辨率，显著提高了白酒风味成分检测的准确性。采用该方法从多种成品酒中分离出91种风味成分，并对其中62种成分建立了定量测定方法。胡国栋等[10]则利用毛细管色谱柱气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrum，GC-MS）直接进样分析，实现了对包括C2～C18的脂肪酸和3种芳香酸在内的23种有机酸的有效测定。目前，毛细管色谱柱气相色谱在我国白酒厂已实现广泛应用，成为白酒质量控制的重要手段。

2 000年后，多维气相色谱（multidimensional gas chromatography，MDGC）和气相色谱-嗅闻（gas chromatographyolfactory，GC-O）技术开始应用于白酒风味成分的研究，白酒风味成分分析获得了飞速发展。2005年，FAN W等[11-12]首次在国内应用GC-O技术对浓香型和兼香型白酒的香气化合物进行了全面研究，从浓香型白酒及兼香型白酒中分别检测出96种、90种呈香化合物，并鉴定出兼香型白酒中9种香气贡献大的化合物。该技术在定性定量检测白酒中风味成分的基础上，实现了风味成分对白酒的贡献的分析；2007年，季克良等[13]采用全二维气相色谱-飞行时间质谱联用（comprehensive two-dimensional gas chromatography-time of flight-mass spectrometry，GC×GC TOF MS）仪分析白酒中风味成分，解决了传统一维色谱技术峰容量不足的缺点。多种色谱分析新方法、新技术的综合运用，使得人们对于传承千年的中国白酒认识越来越清晰。

2 白酒风味物质色谱分析方法

2.1 离子色谱法

2.1.1 离子色谱法及特点

离子色谱（ion chromatography，IC）法是利用被测物质的离子性进行分离和检测的色谱法，是白酒中风味物质检测常用方法之一，其最初是作为液相色谱技术的分支。1975年，SMALL H等[14]成功解决了用抑制电导检测器连续检测柱流出物的难题，离子色谱随后广泛应用于无机阴、阳离子和有机离子的分离检测，并独立于高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法成为一门新的色谱分离技术。在我国，离子色谱技术广泛应用于环境和食品分析领域，可用于无机离子、有机酸、甜味剂、防腐剂、食用色素、糖类、生物胺等的检测[15]。

离子色谱法的特点之一是快速方便、灵敏度高、选择性好，可以实现对白酒样品的直接进样分析，同时分析样品中的多种离子化合物。特点之二是可搭配选择性较广的检测系统，除传统的电导检测器外，还有可用于糖类和氨基酸类有机化合物测定的积分安培检测器，以及可用于过渡金属、稀土元素和环境中有机污染物检测的紫外可见光检测器和荧光检测器[16]。

2.1.2 离子色谱法分析白酒中风味成分

离子色谱法目前广泛应用于白酒中有机酸的测定。白酒中有机酸是白酒呈酸味的重要化合物，有机酸类赋予酒体丰满度和酸爽感，对白酒的香气、味觉和口感有重要影响，同时是白酒中重要香气成分酯类的前体物质。不同香型的白酒中有机酸含量在香气物质占比上高达8%～18%[17]，是白酒中非常重要的一类风味物质。

相对于气相色谱，离子色谱在白酒有机酸分析方面具有较多优点：离子色谱样品处理环节简单，无需衍生，无其他有机物干扰；可以实现对白酒中的挥发性有机酸和非挥发有机酸的同时检测，包括中、短碳链的挥发性酸和乳酸及二元羧酸在内的难挥发酸。郭逸臻等[18]采用离子色谱结合电导检测法对未经处理的白酒样品直接进样分析，实现了对白酒中乳酸的定量检测；潘丙珍等[19]建立了离子色谱结合电导检测法测定酒类中有机酸和无机阴离子的分析方法，实现了对酒中11种有机酸和5种无机阴离子的有效检测；吴飞燕等[20]建立了电导抑制离子色谱法测定酒中16种低分子质量有机酸和阴离子的方法，检测限＜0.16 mg/L；宋卫得等[21]建立了梯度淋洗离子色谱法测定白酒中有机酸和阴离子的方法，可同时测定白酒中18种有机酸和8种阴离子；唐坤甜等[22]建立了测定白酒中呈味有机酸的离子色谱法，采用高效阴离子交换分离柱及电导检测器同时分离和检测20种有机酸，并测定了不同香型白酒中有机酸的含量。离子色谱法对含量较高的有机酸的酒样可以采用直接进样分析，同时适用于挥发性有机酸和非挥发有机酸的检测，因而成为有机酸检测的重要工具。然而，部分离子色谱的分析柱填料不能耐受较高浓度的乙醇，需要对酒样用去离子水稀释处理，而对于含量较低的有机酸需要采用适当的降低乙醇的浓度前处理手段进行浓缩后定量。

除应用于白酒中有机酸的测定外，离子色谱法还应用于甜味剂、糖类、氨基酸等成分的检测。甜味剂是食品工业中一类十分重要的食品添加剂，然而为了保护我国传统产品，国标GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中明确规定白酒不允许添加任何甜味剂[23]。杨仁君等[24]用离子色谱法同时测定白酒中甜蜜素、安赛蜜、糖精钠3种人工合成甜味剂，样品只需简单前处理即可直接进样测定，避免了气相色谱、液相色谱等仪器测定时存在的假阳性及柱前衍生复杂性的问题。

2.1.3 离子色谱法用于白酒风味分析的局限性

离子色谱经过长期的发展，具有灵敏度高、选择性好、同时测定多组分和环境友好等优点，已成为复杂基质中超痕量离子态化合物分析的有效工具。然而，离子色谱用于白酒风味成分分析具有局限性，该方法只能用于白酒中离子态化合物的检测，对于白酒中占比更高的非离子态化合物无法进行有效的检测；同时，相对于毛细管色谱柱气相色谱高效的分离能力，可同时分析的成分也相对有限。

2.2 高效液相色谱法

2.2.1 高效液相色谱法及特点

高效液相色谱法是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。高效液相色谱采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，具有高压、高速、高效、高灵敏度的特点；高效液相色谱样品适应范围广，实现了对70%以上的有机化合物的分析，特别是对于气相色谱难以分离的高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分析，其分离分析具有一定优势。高效液相色谱最常用的检测器为紫外可见光检测器，其他检测器还包括荧光检测器、差示折光检测器、可实时定性定量的二极管阵列紫外可见光检测器以及电化学检测器等。

相对于气相色谱广泛应用于白酒易挥发风味成分的分析，液相色谱不受样品挥发度和热稳定性的限制。在实际检测中，液相色谱广泛应用于白酒中非挥发成分包括有机酸、糖组分、氨基酸、维生素、蛋白质、酒花苦味成分、原料真菌毒素、生物胺以及4-乙烯基愈创木酚等的分析。

2.2.2 高效液相色谱法分析白酒风味成分

HPLC对有机酸的测定较为简便快速，方法选择性好、准确度高，可根据样品的性质和构成选择不同的色谱条件（前处理、色谱柱、流动相、检测器），从而使其成为检测有机酸应用最广泛的方法。冯向东[25]利用高效液相色谱仪搭配紫外可见光检测器同时检测白酒中乳酸、乙酸的含量；同时由于不需要对样品进行预分离、衍生化等繁琐的前处理等优点，高效液相色谱技术已发展成为高级脂肪酸的检测的有力工具；廖勤俭等[26]建立一种利用高效液相色谱四级杆飞行时间质谱联用（high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight-mass spectrometry，HPLCQ-TOF-MS）仪检测白酒中高级脂肪酸的方法，并测定了白酒中沸点较高的7种高级脂肪酸（月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、亚麻酸、亚油酸、油酸、硬脂酸）；王银辉等[27]对样品氮吹浓缩后，利用超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪（ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry，UPLC-MS-MS），实现了对没食子酸、阿魏酸、儿茶素、咖啡酸、木犀草素、绿原酸和对香豆酸7种高级脂肪酸的分离检测。

除应用于上述成分检测外，高效液相色谱还广泛应用于白酒中非挥发性化合物包括氨基酸、邻苯二甲酸酯、生物胺、多酚、吡嗪、外源甜味剂等化合物的分离检测。非挥发性化合物虽然可能不呈香气，但会对白酒的味觉和口感有影响，并且与挥发性化合物相互作用从而影响挥发性物质香气的释放，共同影响白酒的风味。因此，在白酒挥发性化合物研究的相对透彻的同时，高效液相色谱对于探索白酒中非挥发性未知成分具有十分重要意义。

2.2.3 高效液相色谱法用于白酒风味分析的局限性

高效液相色谱采用液体作为流动相，在亲和选择分离的同时，由于其扩散性比气体小，造成液相色谱色谱峰展宽、柱效降低这种“柱外效应”。而在气相色谱中，这种柱外区域扩张基本可忽略不计；高效液相色谱缺乏高灵敏度、通用型检测器，且由于白酒的风味成分醇、酸、酯、醛等物质多属于易挥发性物质，其在白酒检测方面的应用广泛性不及气相色谱。

2.3 气相色谱法

2.3.1 气相色谱法分类及特点

气相色谱法是指用气体作为流动相的色谱法。该方法适用于气体物质或可以在一定温度下转化为气体的物质。气相色谱法用气体作为流动相，样品在气相中传递速度快，因而在流动相和固定相之间可瞬间达到平衡，加上可选作固定相的物质很多，并且近年来采用高灵敏选择性检测器，使气相色谱法具有分析速度快、分离效率高、分析灵敏度高、应用范围广等优点。

气相色谱与不同检测器的联用，大大提高了其检测灵敏度，已成为一种具有高效分离鉴定能力的分离检测技术。包括常用于白酒分析的气相色谱-质谱联用仪、气相色谱-嗅闻仪以及全二维气相色谱-飞行时间质谱联用仪等。

2.3.2 气相色谱在白酒风味成分中的应用

长期以来人们对白酒中香味物质的研究主要集中于其中的挥发性、半挥发性组分，而白酒中的醇、醛、酸、酯等多种风味成分多为挥发性有机物质，适合在气相色谱条件下进行分离与分析，因此，气相色谱法发展成为广泛和有效的白酒现代分析方法。国标GB/T 10345—2007《白酒分析方法》中，包括己酸乙酯、乳酸乙酯在内的5种酯以及正丙醇在内的3种醇类的检测均采用了气相色谱法[28]。

袁翰等[29]采用气相色谱-质谱（GC-MS）联用的方法，对泸州地区浓香型白酒2类新酒挥发性组分进行研究。研究发现，新酒中共检测到以酯类、醇类、酸类、醛酮类化合物为主的83种挥发性化合物，其中共有组分51种；郑杨等[30]采用液-液萃取法提取，通过气相色谱-质谱联用技术分析芝麻香型白酒中的香气成分，并通过标准品、美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）11谱库检索、保留指数3种方法进行定性分析，在扳倒井芝麻香型白酒中共鉴定出挥发性成分179种；SUN J等[31]采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）法从36种芝麻香型白酒样品中共检测出125种挥发性成分，通过香气提取物稀释分析（aroma extract dilution analysis，AEDA）进一步鉴定出30种挥发性成分为关键性香气成分；ZHAO D等[32]采用GC-O结合GC-MS方法对古井贡样品进行了分析，共鉴定出60种风味化合物，进一步鉴定其中35种化合物为重要香气物质；孙啸涛等[33]采用涡旋辅助液液微萃取（liquid-liquid extraction，LLE）结合GC-MS法检测了67种酒样中的吡嗪化合物，包括四甲基吡嗪、4-甲基愈创木酚和4-乙基愈创木酚；杨会等[34]采用衍生化法结合气相色谱法对白酒中的非挥发有机酸进行了检测，共测定到27种非挥发性有机酸。衍生化法是气相色谱检测非挥发成分的有效方法，衍生后可以使其具有良好的挥发性及良好的色谱特性，有利于风味成分的检测。

全二维气相色谱具有分辨率高、峰容量大等优点，在2 000年后逐渐发展成为白酒复杂成分分析的有力工具。徐占成等[35]采用搅拌吸附萃取（stir bar sorptive extraction，SBSE）结合GC×GC/TOF MS法，在浓香型白酒中共检测出1 870种组分，在酱香型白酒中检测出1 700种，在清香型白酒中检测出1 300种；陈双等[36]采用顶空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）结合GC×GC/TOF MS法研究了芝麻香型白酒风味物质，检测到1 029个色谱峰，确认了可信度较高的挥发性化合物340种；YAO F等[37]采用LLE和固相微萃取（SPME）法分别结合GC×GC/TOF MS法分析了18种泸州老窖白酒中的挥发性成分，两种萃取方法分别检测到2 482和2 178个色谱峰，使用TOF-MS的数据库Mainlib和Replib，每种酒都有1 300种以上化合物匹配度＞600。

2.3.3 气相色谱法在白酒分析中的局限性

气相色谱法仅能分析在操作温度下能汽化而不分解的物质，对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难，致使其应用受到一定程度的限制；对于非挥发性物质，需要衍生为酯类后才能进气相色谱分析测定，操作繁琐，并且溶剂的反复萃取、有机反应不易定量进而直接影响测定结果的准确性。高效液相色谱在测定白酒中非挥发物质时，显著优于气相色谱法。

3 总结

中国白酒中仅含有1%～2%的风味成分，这些成分的种类和量比关系构成了白酒独特的香型和风格，对白酒的香气、味觉和口感具有重要影响。对中国白酒中风味成分的全面认识，是进一步分析其对白酒香气、味觉和口感影响的基础和前提。随着色谱技术的不断发展，尤其是毛细管色谱柱气相色谱、多维气相色谱以及气相色谱嗅闻技术的应用，使白酒风味成分分析获得了突破性进展，中国白酒风味成分逐渐被人们所了解。然而，覆盖在中国白酒上的面纱并未完全揭开，对中国白酒的认识也并非全面透彻。

本文探讨的3种色谱分析方法，各具优势并存在一定局限性。针对白酒中风味成分种类复杂、低含量及不同的理化特性，需要选择恰当的色谱分析技术。如对易挥发性物质采用气相色谱进行分析；对难挥发性、大分子组分采用高效液相色谱进行分析；对痕量物质可选择专用色谱柱，后续配置高灵敏度检测器进行分析，提高其检出能力；对于具有相同或相近保留指数的化合物则采用二维或多维色谱分析，提高其解析力。色谱分析在推动对中国白酒的认识上发挥了巨大作用，然而完全依靠色谱分析并不能完全清晰剖析其成分，只有通过色谱技术与多种分析手段相互促进、协同发展，才能进一步剖析和明晰中国白酒风味成分，不断加强产品质量控制，进而推动中国白酒行业的健康发展。