四环素胁迫对羊角月牙藻生长及抗氧化系统的影响

王雅学 武鹏鹏 沈洪艳

摘 要：为探究四环素对藻类产生的毒性效应，选择羊角月牙藻（Selenastrum capricornutum）作为受试生物，采用室内试验方法，研究不同质量浓度的四环素（0，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2 mg/L）对羊角月牙藻的生长抑制情况、叶绿素a含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量及活性氧（ROS）水平的影响。结果表明：四环素对羊角月牙藻的生长具有抑制作用，96 h半数效应浓度（EC50）为3.142 mg/L;四环素抑制了羊角月牙藻细胞中的叶绿素a含量;试验96 h时，随着四环素浓度的增大，羊角月牙藻细胞的SOD活性呈现先升高后降低的趋势，MDA含量、ROS水平均表现为升高趋势。因此，四环素可胁迫羊角月牙藻产生氧化应激反应，损害藻体的抗氧化系统，对水生生态系统具有潜在风险。

关键词：环境毒理学;四环素;羊角月牙藻;生长抑制;叶绿素a;氧化胁迫

中图分类号：X171.5   文献标志码：A   doi：10.7535/hbkd.2019yx06013

Abstract：In order to study the toxic effects of tetracycline on algae， Selenastrum capricornutum is selected as the test organism. The growing situation， chlorophyll a contents， superoxide dismutase （SOD） activity， malondialdehyde （MDA） content and reactive oxygen species （ROS） level in the cells of Selenastrum capricornutum after 0， 0.2， 0.4， 0.8， 1.6， 3.2 mg·L-1 tetracycline exposured are studied by indoor test method. The results show that the tetracycline can strongly inhibit growth of Selenastrum capricornutum and the 50% effective concentration （EC50） is 3.142 mg·L-1 during 96 h exposured. Tetracycline treatment inhibits the content of chlorophyll a in the cells of Selenastrum capricornutum. During 96 h exposure period， with the increase of tetracycline concentrations， the activity of SOD shows a "Bell-shaped" trend， the content of MDA and the level of ROS shows an upward trend. The study indicates that tetracycline can cause oxidative stress and damage the antioxidant system in Selenastrum capricornutum cells. Tetracycline poses a potential risk to aquatic ecosystems.

Keywords：environmental toxicology; tetracycline; Selenastrum capricornutum; growth inhibition; chlorophyll a; oxidative stress

四环素类抗生素是世界上应用最为广泛的抗生素之一[1]，中国是四环素类抗生素的生产及使用大国[2]，而四环素（tetracycline）是四环素类抗生素中的典型药物，因其抗菌谱广、质优价廉常被作为动物饲料添加剂，广泛应用于畜牧及水产养殖领域[3]。研究表明，动物所摄入的抗生素中有30%～90%不能被其完全吸收，而是随尿液和粪便一起排至环境中[4]。四环素水溶性较好，易通过各种环境介质转移到地表水、地下水中[5]。那广水等[6]采集了中国北方13个市政排污口及相关河流水样，结果发现在近岸污水排放中四环素类抗生素的质量浓度可达1.114 μg/L。有研究显示，黄浦江中四环素类抗生素的质量浓度为0.44～2.69 μg/L[7]。部分地区的地下水也已经检测到四环素的存在，质量浓度达到0.003 6 μg/L[8]。四环素化学结构非常稳定，大部分可在环境中存留1年以上[9]，对生态环境的影响不容忽视。姜蕾等[10]研究发现，四环素暴露能够阻碍铜绿微囊藻的光合作用，破坏抗氧化酶的系统平衡，抑制藻类生物量的增长。周旭东[11]研究后認为，四环素类抗生素主要通过破坏细胞膜结构来抑制藻类生长。李捷[12]研究表明，四环素作用下莱茵衣藻内的抗氧化酶活性被激发。藻类是水生生态系统内重要的初级生产者，四环素可能通过食物链由低营养级向高营养级富集，进而影响整个水生生态系统，最终危害人类健康，因此，有必要进一步探讨四环素对藻类的效应浓度及其生态毒性。

羊角月牙藻（Selenastrum capricornutum）是一种淡水绿藻，易于分离培养且繁殖周期较短，对毒性物质较为敏感[13]，可被作为生物毒性模式生物[14-15]，也是生态环境部藻类毒性测试中的推荐藻种之一[16]。因此，本研究以四环素作为研究对象，以羊角月牙藻作为受试生物，通过测定四环素暴露下羊角月牙藻细胞的生长抑制情况、叶绿素a含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量、活性氧（ROS）水平的变化，探究四环素对羊角月牙藻的毒性效应，以期为四环素的安全合理使用、污染治理及相关环境风险评估提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

羊角月牙藻（FACHB-271）购自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库，在无菌条件下，将藻种重悬于BG11培养基中，置于锥形瓶中在人工气候培养箱（PRX-250B，宁波赛福实验仪器有限公司提供）内培养，培养温度为25 ℃，光照强度为12 000 lux，光照周期为14 h光照+10 h黑暗，每日定期摇晃锥形瓶3次，每次5 min，同时随机调整锥形瓶位置以使藻细胞受光均匀，选取对数生长期的羊角月牙藻细胞进行四环素毒性效应研究。四环素（分析纯）购自上海阿拉丁试剂有限公司。

1.2 染毒试验

将对数生长期的羊角月牙藻细胞离心收集（3 500 r/min，4 ℃，10 min），去除上清液，用无菌超纯水清洗3次，将收集到的藻细胞接种至培养基中，加入一定量的四环素溶液。通过预试验探明四环素对羊角月牙藻生长的有效浓度影响范围。根据预试验的结果，设置四环素质量浓度梯度分别为0（空白对照），0.2，0.4，0.8，1.6，3.2 mg/L，并同时进行3个平行组。在试验开始后的第24，48，72，96 h取样，进行其他测定工作。

1.3 藻细胞生长测定

在试验开始后第24，48，72，96 h分别取样，并于显微镜下观察藻类生长状况，使用血球计数板进行计数，确定藻细胞的密度;同时用紫外分光光度计测定藻细胞在波长为684 nm下的吸光度，以建立藻细胞密度与OD684之间的线性关系。

1.4 叶绿素a含量的测定

叶绿素a含量的测定采用分光光度法，取5 mL藻液，离心收集（8 000 r/min，10 min）后，弃去上清液，将藻细胞重悬于体积分数为95%的乙醇中，75 ℃水浴3 min，再次离心（8 000 r/min，10 min）后，用紫外分光光度计测定上清液在波长665 nm和649 nm下的吸光度[17]。叶绿素a含量计算公式为Ca=13.95 A665-6.88 A649，式中，Ca为叶绿素a的浓度;A665和A649为叶绿素溶液在波长665 nm和649 nm下的吸光度。

1.5 酶活性的测定

取20 mL藻液，离心收集（6 500 r/min，10 min）后，弃去上清液，使用预冷的PBS缓冲溶液清洗3次，重悬于PBS缓冲溶液中，使用超声波细胞破碎仪冰浴破碎10 min，离心（10 000 r/min，4 ℃，10 min）后取上清液于冰中储存待测。超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）含量均采用南京建成工程研究所的检测试剂盒测定。

1.6 活性氧（ROS）水平的测定

采用SHEN等[18]提出的化學荧光法测定ROS水平。将DCFH-DA试剂用培养基以1∶1 000进行稀释，使其工作浓度为10 mmol/L。取1 mL藻液，离心（3 500 r/min，15 min）后，用PBS缓冲溶液清洗3次，使用500 μL稀释后的DCFH-DA试剂重悬，将重悬后的藻细胞放入人工气候培养箱中孵育50 min，孵育完成后离心（7 100 r/min，15 min），并用BG11基础培养基清洗3次，重悬于1 mL培养基中，取200 μL置于96孔板，每个浓度设置3个复孔，使用多功能酶标仪在激发波长485 nm、发射波长525 nm下进行测定。

1.7 数据分析

试验结果用“均值±标准差”表示。采用SPSS 19.0软件对数据进行单因素方差分析（one way ANOVA），并用Tukeys作组间多重比较。试验中所有图表均使用软件Origin 8.6绘制，其中：*代表p<0.05，**代表p<0.01，均表示差异显著;***代表p<0.001，表示差异极显著。

2 结果与讨论

2.1 四环素对羊角月牙藻生长的影响

根据藻细胞密度与OD684的测定结果，建立二者之间的线性关系为y=4.627 4x+0.964，R2=0.997 4，该线性回归模型拟合优度较高，可信性较好。观察试验开始后24，48，72，96 h时，不同浓度四环素对羊角月牙藻细胞密度的影响如图1所示。由图1可以看出，48 h后中高浓度四环素（≥ 0.8 mg/L）胁迫下的藻细胞生长呈现一定的抑制状态;96 h时，与对照组相比，0.2 mg/L试验组的藻细胞生长被显著性抑制（p<0.05），其余试验组的藻细胞生长均被极显著性抑制（p<0.001），其中羊角月牙藻在3.2 mg/L四环素的作用下，96 h生长抑制率达到50.8%。试验结果表明，四环素对羊角月牙藻的生长繁殖具有抑制作用。随着四环素浓度的升高和试验时间的延长，羊角月牙藻的细胞密度逐渐减小，四环素对羊角月牙藻的抑制效应也越明显，呈现一定的“浓度-效应”及“时间-效应”关系。根据试验结果，由SPSS软件计算可知，96 h时四环素对羊角月牙藻的半数效应质量浓度（96 h-EC50）及抑制效应为80%时的四环素质量浓度（96 h-EC80）分别为3.142 mg/L和6.309 mg/L。徐冬梅等[19]在四环素对淡水绿藻的毒性研究中发现四环素对蛋白核小球藻的96 h-EC50值及96 h-EC80值分别为6.86 mg/L和17.78 mg/L;对斜生栅藻的96 h-EC50值及96 h-EC80值分别为3.27 mg/L和12.87 mg/L。周旭东[11]研究了四环素对铜绿微囊藻、小球衣藻的毒性，得出其96 h-EC50值分别是10.394 mg/L和2.038 mg/L。与以上研究结论类比可知，四环素胁迫下，羊角月牙藻的96 h-EC50值及96 h-EC80值均低于蛋白核小球藻及斜生栅藻;羊角月牙藻的96 h-EC50值低于铜绿微囊藻，但高于小球衣藻。羊角月牙藻对四环素胁迫较为敏感。

2.2 四环素对羊角月牙藻叶绿素a含量的影响

藻类的生长发育离不开光合作用，而叶绿素就是光合作用重要的基础物质，故叶绿素含量的变化影响光合作用的速率，进而影响藻类的生长状况[20]。而研究发现，叶绿素b是由叶绿素a演变而来的[21]，叶绿素a的含量决定了藻体内叶绿素的总量，故叶绿素a的合成和转化对藻类的生长至关重要，所以叶绿素a的含量与藻类生物量有着紧密的联系。四环素对羊角月牙藻叶绿素a含量的影响如图2所示。由图2可以看出，与对照组相比，1.6 mg/L试验组的叶绿素a含量在试验24，48，72 h均被显著性抑制（p<0.01），在试验96 h时被极显著性抑制（p<0.001）;3.2 mg/L试验组的叶绿素a含量在试验期间均被极显著性抑制（p<0.001）。本试验中，在3.2 mg/L四环素的胁迫下，与对照组相比，羊角月牙藻的叶绿素a含量在试验96 h时显著下降27%。四环素的存在降低了藻类叶绿素a的含量，且随四环素浓度的增大，抑制效果更为显著。张迪等[22]研究表明金霉素会使斜生栅藻细胞内的叶绿体发生萎缩，影响其正常的生长代谢。段炼等[23]发现在1-丁基-3-甲基咪唑氯盐的胁迫下，斜生栅藻叶绿体的片层结构断裂，叶绿素含量下降。四环素胁迫可能导致藻细胞的叶绿素分子受损，影响藻细胞的新陈代谢及正常光合作用的进程，进而危害羊角月牙藻的正常生长繁殖过程。

2.3 四环素对羊角月牙藻SOD活性的影响

SOD是一种诱导酶类，其活性升高可以消除体内的ROS，防止机体抗氧化损伤[24-25]。不同浓度的四环素对羊角月牙藻SOD活性的影响如图3所示。试验24 h时，与对照组相比，各试验组SOD活性均出现增长，其中1.6，3.2 mg/L试验组的SOD活性被显著性诱导（p<0.05），说明在试验初期，藻体在较高浓度的四环素（≥1.6 mg/L）胁迫下产生大量ROS，藻细胞SOD活性升高以消除体内过量的ROS;试验96 h时，与对照组相比，0.2 mg/L试验组的SOD活性被显著性诱导（p<0.01），0.4 mg/L试验组的SOD活性被显著性诱导（p<0.05），而3.2 mg/L试验组的SOD活性被显著性抑制（p<0.05），羊角月牙藻经四环素暴露96 h后，较低浓度的四环素（≤0.4 mg/L）试验组中，藻细胞的SOD活性升高以增强对ROS的清除能力，而高浓度的四环素（3.2 mg/L）胁迫超出了藻体正常歧化能力，抗氧化系统遭到破坏，氧化损伤加剧，SOD活性降低。在四环素胁迫下，羊角月牙藻机体产生大量ROS，SOD作为抵御机体氧化损伤首先起作用的酶类，可以在一定程度内调节机体内的ROS水平[26]。PAPADIMITRIOU等[27]研究表明，当生物体受到轻度逆境胁迫时，SOD活性往往升高以清除过量的ROS，而当胁迫进一步加剧，SOD活性常常降低。本试验的SOD活性呈现了與之相同的趋势：在3.2 mg/L试验组中，SOD活性在试验初期（24 h）被显著性诱导，末期（96 h）时被显著性抑制。

2.4 四环素对羊角月牙藻MDA含量的影响

研究表明，生物体在转化外源污染物质的过程中会导致ROS的产生[28]，而过量的ROS会与生物膜中的多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，生成过氧化产物MDA，而MDA的出现又将进一步加剧膜损伤状况[29]，所以MDA含量可以体现细胞膜脂质过氧化的程度[30]，同时可以体现机体受ROS攻击的情况。如图4所示，在试验初期（24 h），与对照组相比，0.8 mg/L试验组的藻细胞MDA含量被显著性诱导（p<0.05），1.6 mg/L试验组的藻细胞MDA含量被极显著性诱导（p<0.001）;试验48 h时，3.2 mg/L试验组的MDA含量被极显著性诱导（p<0.001）至试验期间最大值，其余各试验组的MDA含量均被显著性诱导（p<0.05），表明四环素可引起羊角月牙藻的氧化应激反应，产生过量的ROS攻击膜不饱和酸，发生脂质过氧化反应，使其产物的MDA含量升高;试验72 h时，与对照组相比，1.6，3.2 mg/L试验组的藻细胞MDA含量均被显著性诱导（p<0.05）;试验96 h时，与对照组相比，除0.2 mg/L试验组外，其他各试验组的MDA含量均被极显著性诱导（p<0.001），说明四环素胁迫导致的羊角月牙藻氧化损伤效应持续。高问等[31]在土霉素废水对斑马鱼肌肉组织MDA含量的影响研究中发现，暴露15 d时，与对照组相比，各暴露组的MDA含量被显著性诱导。沈洪艳等[32]研究发现，70%试验组的链霉素废水对斑马鱼肌肉组织的MDA含量产生诱导作用，造成严重的氧化损伤。将本试验结果与其他指标对比可知，羊角月牙藻的MDA含量对四环素胁迫较为敏感。试验96 h时，不同浓度四环素胁迫下的羊角月牙藻细胞内的MDA含量随四环素浓度的增大呈现升高趋势，该结果与刘伟杰等[33]在壬基酚对羊角月牙藻MDA含量影响的研究结果类似：壬基酚浓度越高，羊角月牙藻的细胞膜脂质过氧化程度越严重。

2.5 四环素对羊角月牙藻ROS水平的影响

活性氧（ROS）是细胞在有氧条件下进行能量代谢产生的一类具有氧化活性的分子总称[34-35]。正常条件下，机体中产生的ROS可通过抗氧化系统（酶促系统和非酶促系统）的调节，稳定在动态平衡状态，当机体受到胁迫时，ROS过量积累或抗氧化酶的消耗将破坏平衡，引起机体氧化应激反应[36]，如生物膜过氧化、蛋白质变性、植物细胞光合作用受阻、酶的失活等，进一步引起氧化损伤[19]。当细胞内ROS水平超过机体抗氧化能力和修复水平时，将诱导细胞凋亡[24]。由图5所示，与对照组相比，3.2 mg/L试验组的ROS水平在试验48，72，96 h时均被显著性诱导（p<0.05）;1.6 mg/L试验组的ROS水平在96 h被显著性诱导（p<0.05），较高浓度的四环素（≥1.6 mg/L）在试验48 h后显著提升了藻细胞内的ROS水平，表示在较高浓度四环素（≥1.6 mg/L）的持续胁迫下，藻细胞内的ROS水平已经超出了细胞自身调节及解毒能力，ROS产生与清除的动态平衡状态被打破，危害藻体抗氧化系统。

3 结 论

1）四环素对羊角月牙藻的生长具有抑制作用，四环素对羊角月牙藻的96 h-EC50值为3.142 mg/L。

2）四环素能够降低羊角月牙藻的叶绿素a含量，抑制羊角月牙藻的光合作用，影响其正常生长进程。

3）高浓度四环素（3.2 mg/L）在试验初期（24 h）对羊角月牙藻细胞的SOD活性有显著性诱导作用，末期时（96 h）呈现显著性抑制作用。试验期间，四环素对藻细胞的MDA含量、ROS水平具有不同程度的诱导作用。试验96 h时，随着四环素浓度的增大，羊角月牙藻细胞的SOD活性呈现先升高后降低的趋势;MDA含量、ROS水平表现为升高趋势。四环素胁迫使羊角月牙藻产生氧化应激反应，对藻体抗氧化系统造成损伤。

4）四环素对羊角月牙藻生长及抗氧化系统的影响是个复杂的过程，本文选取了生长抑制情况、叶绿素a含量、SOD活性、MDA含量、ROS水平等表征生长和抗氧化的典型指标进行了测定与分析，今后可进一步在毒性作用机制、基因表达水平等更深层面进行探究。

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