外周血循环肿瘤细胞及其变化在局部晚期鼻咽癌疗效判断及预后预测中的作用

曾伟华 李微绽 邹国荣 曹小龙 何艳 李娟 苏珍 唐杰

【摘要】 目的：探討外周血循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）及其变化在局部晚期鼻咽癌疗效判断及预后预测中的作用。方法：收集2016年6月-2017年6月本院收治的局部晚期鼻咽癌患者60例，利用抗体标记和流式细胞仪联合方法，分别检测患者在接受治疗前、治疗后3周及治疗后3个月的外周血CTCs数量，且平均随访24个月，对包括CTCs在内的预后因子进行统计分析，探索CTCs及其变化与局部晚期鼻咽癌疗效、预后之间的关系。结果：单因素分析结果显示，CTCs水平与N分期明显相关（P<0.05）;Logistic多因素回归分析结果显示，CTCs水平与N分期有相关性（P<0.05），CTCs阳性患者的N分期更晚;与治疗前相比，治疗后3周、3个月的CTCs数目及阳性率均显著降低（P<0.05）;治疗后3个月CTCs阴性患者的RR显著高于CTCs阳性患者（P<0.05）;根据Kaplan-Meier生存分析结果显示，CTCs阳性患者的总生存时间（overall survival，OS）明显短于CTCs阴性患者，2年总生存率分别为83.26%和91.23%，差异有统计学意义（P<0.05）;且治疗后随访期间，CTCs阴性组转移复发率均明显低于CTCs阳性组（P<0.05）。结论：外周血CTCs检测可用于局部晚期鼻咽癌的疗效评价，且对患者疗效具有一定的预后预测价值，可能成为鼻咽癌患者早期发现疾病进展及预后评估的一个辅助指标，进而为制定个体化诊断和治疗提供可靠依据。

【关键词】 循环肿瘤细胞 局部晚期鼻咽癌 预后

[Abstract] Objective： To investigate the role of peripheral blood circulating tumor cells （CTCs） and their changes in the evaluation of curative effect and prognosis of locally advanced nasopharyngeal carcinoma. Method： A total of 60 patients with locally advanced nasopharyngeal carcinoma admitted to our hospital from June 2016 to June 2017 were collected. The number of CTCs in peripheral blood of patients before treatment， 3 weeks after treatment and 3 months after treatment were detected by antibody labeling and flow cytometry， and the average follow-up was 24 months， the prognostic factors including CTCs were given statistical analysis， the relationship between CTCs and their changes and the efficacy and prognosis of locally advanced nasopharyngeal carcinoma were analyzed. Result： Univariate analysis showed that CTCs level was significantly correlated with N stage （P<0.05）. Logistic multivariate regression analysis showed that CTCs level was correlated with N stage （P<0.05）， and N stage was later in CTCs positive patients. Compared with before treatment， the number and positive rate of CTCs were significantly decreased after 3 weeks and 3 months of treatment （P<0.05）. RR of CTCs negative patients was significantly higher than that of CTCs positive patients after 3 months of treatment （P<0.05）. According to Kaplan-Meier survival analysis， the total survival time （OS） of CTCs positive patients was significantly shorter than that of CTCs negative patients， and the 2-year overall survival rate were 83.26% and 91.23% respectively， the difference was statistically significant （P<0.05）. Moreover， during the follow-up period after treatment， the recurrence rate of metastasis in the CTCs negative group was significantly lower than that in the CTCs positive group （P<0.05）. Conclusion： The detection of CTCs in peripheral blood can be used to evaluate the curative effect of locally advanced nasopharyngeal carcinoma， and has certain prognostic value for patients， it may be an auxiliary index for early detection of disease progression and prognosis evaluation of nasopharyngeal carcinoma patients， and provide reliable basis for making individualized diagnosis and treatment.

[Key words] Circulating tumor cells Locally advanced nasopharyngeal carcinoma Prognosis

First-authors address： Guangzhou Panyu District Central Hospital， Guangzhou Panyu Area Tumor Research Institute， Guangzhou 511400， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.32.035

鼻咽癌是我国华南地区的高发恶性肿瘤之一[1]，发现时70%已为局部晚期。局部晚期鼻咽癌是指鼻咽肿瘤占据颈动脉鞘区，或肿瘤侵犯鼻窦、眼眶、颞下窝、颅底、翼突、翼腭窝及第1～2颈椎之一者，常伴有颅神经损害或下颈、锁骨上淋巴结转移，病灶侵犯广泛，极易复发及远处转移，具有死亡率高、治疗效果差、5年生存率低等特点[2]。目前，针对局部晚期鼻咽癌患者的主要模式为以同期放化疗辅加新辅助化疗或辅助化疗的综合治疗[3]。近年来，随着放射影像、放疗技术、化学治疗的发展，尤其是调强放射治疗等先进的放疗技术应用得到普及，局部晚期鼻咽癌患者的生存期及局部控制率得到明显提高，而放化疗后肿瘤远处转移成为鼻咽癌治疗的主要失败模式[4]。因此，如何减少此类患者肿瘤的转移成为研究的热点。循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）理论为医务工作者对肿瘤的发生发展、转移有了新的认识。在肺癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、胰腺癌等实体肿瘤中，循环肿瘤细胞已被发现对肿瘤的辅助诊断、疗效评价、复发转移监测和预后判断等有积极的临床指导意义[5-6]。但现在国内尚无足量循环肿瘤细胞在鼻咽癌患者中的表达情况及其与疾病疗效判断及预后预测的报道，因此，本研究探讨了外周血循环肿瘤细胞及其变化在局部晚期鼻咽癌疗效判断及预后预测的作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年6月-2017年6月本院收治的60例局部晚期鼻咽癌患者作为研究对象。60例患者中，男32例，女28例;年龄20～65岁，中位年龄48岁;分期参照AJCC/UICC 7th标准，Ⅲ期33例，ⅣA期17例，ⅣB期10例。纳入标准：均为初诊患者，临床试验开始前未行放疗或化疗;病理确诊为鼻咽非角化癌（分化型或未分化型，即WHO Ⅱ型或Ⅲ型）;肿瘤分期为T3～4N0～1M0、T1～4N2～3M0，Ⅲ、ⅣA、ⅣB（UICC2010分期）;年龄18～65岁;卡氏评分（Karnofsky scale，KPS）≥70分。排除标准：既往有恶性肿瘤病史或同时患其他脏器恶性肿瘤;伴有严重精神系统疾病或严重过敏史;合并严重免疫系统或造血系统等原发性疾病;合并心、肺、肾等重要脏器功能不全;处于妊娠期或哺乳期妇女。研究已取得伦理委员会批准，患者及其家属均知情并签署同意书。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法 （1）诱导化疗：所有患者均接受2～3个疗程诱导化疗，诱导化疗方案为TP[多西他赛（生产厂家：江苏恒瑞医药股份有限公司，批准文号：国药准字H20123222）70 mg/m2，d1，d22，d43，静滴;顺铂（生产厂家：江苏豪森药业集团有限公司，批准文号：国药准字H20040813）20 mg/m2，d1～4，d22～25，d43～46，静滴]、TPF[多西他赛60 mg/m2，d1，d22，d43，静滴;顺铂20 mg/m2，d1～3，d22～24，d43～45，静滴;氟尿嘧啶（生产厂家：山西普德药业有限公司，批准文号：国药准字H20051113） 600 mg/m2，d1～5，d22～26，d43～47，静滴]、PF[顺铂30 mg/m2，d1～3，d22～24，d43～45，静滴氟尿嘧啶750 mg/m2，d1～4，d22～25，d43～46，静滴]。化療期间，每周至少接受一次临床检查和实验室检验。（2）同期放化疗：所有患者均采用相同的调强放射治疗（IMRT）技术，靶区的剂量建议：PTVnx：68.0～70.4 Gy/30～32 f;PTVnd：64.0～70.4 Gy/30～32 f;PTV1：60.0～64.0 Gy/30～32 f;PTV2：50.0～54.0 Gy/30～32 f。处方剂量为95%的PTV体积所接受的最低吸收剂量;且放疗期间均采用顺铂25～30 mg/（m2·周），共6次;在同期放化疗结束后4周进行2个疗程辅助化疗，化疗方案同诱导化疗。

1.2.2 CTCs检测方法 采用莱尔生物循环肿瘤细胞检测技术。应用真空采血管采集肘正中静脉血5 mL置于ACD抗凝管中。采集的血液在48 h内去除血浆，裂解液去除红细胞，磁珠孵育混匀去除白细胞，分离液分离富集肿瘤细胞。使用CD45抗体进行细胞免疫荧光检测，8号着丝粒探针进行荧光原位杂交。在荧光显微镜下计数，二倍体信号或CD45阳性为正常细胞，大于等于三倍体且CD45阴性为异常细胞。根据试剂盒的说明书，≥2个异常细胞判断为循环肿瘤细胞阳性。

1.3 观察指标与判定标准 比较治疗前后局部晚期鼻咽癌患者CTCs的检测结果;比较治疗前后CTCs变化与局部晚期鼻咽癌患者疗效的关系;局部晚期鼻咽癌CTCs与患者预后的相关性。参考世界卫生组织（WHO）制定的实体瘤客观疗效评价标准，完全缓解（CR）：所有目标病灶消失，或所有非目标病灶消失且肿瘤标志物水平正常，且至少维持4周;部分缓解（PR）：基线病灶长径总和缩小≥30%;进展（PD）：基线病灶长径总和增加≥20%，或出现新病灶，或出现新病灶伴有（不伴有）非目标病灶;稳定（SD）：基线病灶长径总和有缩小但未达PR，或有增加但未达PD。总有效（RR）=CR+PR。

1.4 统计学处理 采用SPSS 22.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验。并运用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，生存率的比较采用log-rank检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CTCs水平与临床特征的相关性 单因素分析结果显示，CTCs水平与患者年龄、性别、T分期及M分期均无关（P>0.05），而与N分期明显相关（P<0.05）;Logistic多因素回归分析结果显示，CTCs水平与N分期有相关性（P<0.05），CTCs阳性患者的N分期更晚。见表1。

2.2 治疗前后局部晚期鼻咽癌患者CTCs的检测结果比较 治疗后3周与治疗前的CTCs数目、阳性情况相比，差异均有统计学意义（t=4.78，字2=6.23，P<0.05）;治疗后3个月与治疗前相比，差异均有统计学意义（t=5.12，字2=5.76，P<0.01），即治疗后3周及治疗后3个月的CTCs数目及阳性率均显著降低。见表2。

2.3 治疗前后CTCs变化与局部晚期鼻咽癌患者疗效比较 根据RECIST 1.1标准进行疗效评估，治疗后3个月CTCs阴性患者的RR显著高于CTCs阳性患者，差异有统计学意义（字2=4.97，P=0.00），见表3。

2.4 局部晚期鼻咽癌CTCs与患者预后的相关性分析 根据Kaplan-Meier生存分析结果显示，CTCs阳性患者的总生存时间（overall survival，OS）明显短于CTCs阴性患者，2年总生存率分别为83.26%和91.23%，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。

2.5 治疗后CTCs变化与局部转移复发率比较 治疗后随访期间，CTCs阴性组转移复发率均明显低于CTCs阳性组，差异有统计学意义（P<0.05），见表4。

3 讨论

鼻咽癌作为临床中发病率较高的一种恶性肿瘤，在耳鼻咽喉肿瘤的发病率中占据首位[7-8]。据流行病学调查表明，受人们生活习惯的改变、居住环境、病毒感染等因素影响，其发病率和死亡率呈逐渐上升之势，引起了临床上的高度重视。有研究显示，虽然肿瘤综合治疗与放射治疗技术的发展已使多种恶性肿瘤的治愈率及5年存活率明显提高，但局部晚期鼻咽癌患者的5年生存率仍在45%～55%，而治疗失败原因主要是局部复发和远处转移[9-10]。现阶段临床上预测肿瘤的复发和预后风险主要依靠综合肿瘤影像学资料、病理学特征等，但这些检查手段对肿瘤病灶的远处转移无法及时和准确发现，患者生存获益较小[11-12]。因此，寻找鼻咽癌评估患者疗效及预后的新型辅助指标就显得非常重要。

近年来，随着医疗技术以及分子靶向技术的不断进步与发展，更多的肿瘤分子标记物被发现和应用，为评估治疗效果及预测预后提供了新的思路和方法[13]。近年来有临床试验研究发现，检测外周CTCs在鼻咽癌早期诊断、病情发展监测和预后判断及疗效评估等方面均有重要参考价值[14-15]。CTCs是自发或因诊疗操作由原发灶或转移灶直接或经淋巴系统间接释放进入外周血循环的肿瘤细胞，进而在远处组织、器官增殖，是恶性肿瘤患者出现术后复发和远处转移的重要原因[16]。因此，连续检测CTCs对局部晚期鼻咽癌患者系统性治疗的有效性及预后评价具有十分重要的临床意义。文献[17-18]报道，同步放/化疗治疗等综合治疗模式是局部晚期鼻咽癌患者的主要治疗手段，其疗效优劣直接关系到患者的生存质量及存活时间，而疗效评判的准确性又影响治疗方案的施行，间接影响患者的个体化治疗，而CTCs对放化疗反应敏感，其检测方法简单，创伤小，重复性好，更能真实地反应鼻咽癌患者肿瘤的生物学特性[19-20]。本研究单因素分析及Logistic多因素回归分析结果显示，CTCs水平与N分期明显相关（P<0.05），CTCs阳性患者具有更晚的N分期，且进一步分析发现，与治疗前相比，治疗后3周、3个月CTCs数目及阳性率均显著降低（P<0.05），说明CTCs数目变化可被用来评估对治疗的反映，能在治疗的早期阶段识别病情是否正在被控制，當前的治疗方式是否对疾病转归产生积极作用，有助于临床医师及时改变治疗方案，及时更换干预措施，实行精准医疗，一定程度上提高患者无疾病进展期和生存率。且该研究根据RECIST 1.1标准进行疗效评估，发现治疗后3个月CTCs阴性患者的RR显著高于CTCs阳性患者（P<0.05），提示治疗过程中CTCs的变化与疗效有关，能有效及时地评价疗效结果，成为早期评估鼻咽癌病情进展的一个有益的补充。本研究生存分析结果显示，CTCs阳性患者OS明显短于CTCs阴性患者（P<0.05），且CTCs阳性患者的淋巴结分期、局部转移复发率均明显高于CTCs阴性患者（P<0.05），这说明CTCs阳性患者的总生存期更短，预后更差，进一步提示连续监测CTCs对患者预后有一定的预测作用。

综上所述，外周血CTCs检测可用于局部晚期鼻咽癌的疗效评价，且对患者具有一定的预后预测价值，可能成为鼻咽癌患者早期发现疾病进展及预后评估的一个辅助指标，进而为制定个体化诊断和治疗提供可靠依据，值得临床推荐应用。

参考文献

[1] Li J X，Huang S M，Jiang X H，et al.Local failure patterns for patients with nasopharyngeal carcinoma after intensity-modulated radio therapy[J].Radiation Oncol（London，England），2014，9（53）：87-90.

[2] Mu Z，Wang C，Ye Z，et al.Prospective assessment of the prognostic value of circulating tumor cells and their clusters in patients with advanced-stage breast cancer[J].Breast Cancer Research and Treatment，2015，154（3）：563-571.

[3] Tjensvoll K，Nordg?rd O，Smaaland R.Circulating tumor cells in pancreatic cancer patients：methods of detection and clinical implications[J].Int J Cancer，2014，134（1）：1-8.

[4] Jiang R，Cai X Y，Yang Z H，et al.Elevated peripheral blood lymphocyte-to-monocyte ratio predicts a favorable prognosis in the patients with metastatic nasopharyngeal carcinoma[J].Cancer，2015，34（6）：23-26.

[5]郝帅，田武国，孙启慧，等.循环肿瘤细胞在转移性乳腺癌治疗及预后评价中的应用进展[J/OL].中华乳腺病杂志电子版，2016，10（2）：105-108.

[6]郑磊，陈静.循环肿瘤細胞检测新进展及临床价值[J].中华检验医学杂志，2016，39（8）：565-567.

[7]伍勇，翁成荫，方喜生，等.循环肿瘤细胞与鼻咽癌临床病理参数的相关性研究[J].中国医药科学，2015，15（9）：17-19.

[8]李伟，马德亮，李燕，等.转移性乳腺癌循环肿瘤细胞检测对化疗疗效的评价[J].中华肿瘤防治杂志，2015，22（24）：1889-1893.

[9]唐红，吴伟莉，金风.外周血中性粒细胞及血小板与淋巴细胞的比值与局部晚期鼻咽癌预后及疗效的相关性[J].肿瘤防治研究，2019，46（01）：38-42.

[10]吴君心，贺俊彦，杜开新.鼻咽癌患者外周血循环肿瘤细胞的检测及其与预后的相关性[J].现代肿瘤医学，2017，25（7）：47-51.

[11]梁莉丽，孙迪，宋海涛.局部晚期鼻咽癌患者外周血VEGF检测及意义[J].现代生物医学进展，2015，15（3）：510-513.

[12]努热古·阿热甫，韩潇，胡云辉.局部晚期鼻咽癌患者外周血淋巴细胞亚群与预后的相关性[J].新疆医科大学学报，2018，41（12）：70-75.

[13]罗秀玲，金风，毕婷.TPF方案诱导化疗不同给药方式联合调强放疗治疗局部晚期鼻咽癌的中期疗效及预后分析[J].中华放射医学与防护杂志，2018，38（8）：595-601.

[14]彭政，李文峰.尼妥珠单抗联合调强适形放疗治疗晚期局部鼻咽癌临床疗效及预后分析[J].中国基层医药，2017，24（11）：1727-1731.

[15]杨健筌，郭文，文世民.新辅助化疗联合同步放化疗对局部晚期鼻咽癌预后影响的Meta分析[J].肿瘤预防与治疗，2017，30（3）：12-13.

[16]欧瑶，罗居东.诱导化疗加IMRT同期化疗治疗96例局部晚期鼻咽癌远期疗效[J].实用医学杂志，2017，33（2）：45-46.

[17]付新洒，曹彦洋，李冠雪，等.外周血循环hTERT mRNA和CK19 mRNA的表达与鼻咽癌肿瘤微转移的相关性研究[J].重庆医学，2018，47（24）：48-51，55.

[18]梁嵘，李永强，胡晓桦，等.ERCC1蛋白表达与局部晚期鼻咽癌同步放化疗疗效的关系[J].临床肿瘤学杂志，2014（3）：240-243.

[19]潘琦津，龚建忠，韦燕.转移性鼻咽癌维持治疗研究现状及进展[J].现代肿瘤医学，2018，26（21）：168-171.

[20]娄繁，杨锫，张荣，等.局部复发鼻咽癌再程调强放疗的临床疗效和预后研究[J].医学临床研究，2015，32（10）：2010-2013.

（收稿日期：2019-07-31） （本文编辑：程旭然）