食品中丙烯酰胺检测技术研究进展

王祖文,黄光智，丁晓雯*

1(西南大学 食品科学学院，重庆市农产品加工重点实验室，食品科学与工程国家级实验教学示范中心，重庆，400716) 2(西南大学 科技处，重庆，400716)

丙烯酰胺(acrylamide,AA)是一种无色无味的有机小分子化合物，在常温常压下多以固体形式存在，具有结晶性，分子量低，可溶于水、乙醇、丙酮，不易挥发，对光线敏感，在紫外线作用下易发生聚合形成聚丙烯酰胺[1-2]。AA在1994年被国际癌症研究机构(IARC)划分为“人类可能致癌物”(2A类)[3]，对动物具有致癌、生殖毒性、遗传毒性[4]等多种作用，对人的神经毒性[5-6]也得到证实。油炸及焙烤的淀粉类等经高温加工的食品中存在含量不等的AA，在一定的温度范围内其含量随着加工温度的升高而增加[7]，例如油炸薯片、饼干、面包等熏烤制品都可能存在较大量的AA，对人类健康存在潜在的危害。食品中AA含量的波动性很大，根据欧洲食品安全局(EFSA)对不同食品中AA的监测报告显示，食品中AA的平均含量在31μg/kg(婴幼儿加工谷物食品)～1 350μg/kg(咖啡替代品)范围内[8]。据报道，对于神经毒性的AA每日可耐受摄入量(TDI)为40mg/(kg·d)，致癌的TDI为2.6mg/(kg·d)[9]，因此，为了消费者的健康应加强食品中AA的监控。

近几年来，对AA的检测方法有很大发展，除了常规的气相、液相及其联用技术外，新型的检测技术如基于褐变的快速测定、毛细管电泳、酶联免疫分析技术、生物传感器及荧光传感等也得到了发展(表1)。本文就AA各检测方法的优缺点及在实际生产中的应用进行综述比较，为开发简单、便捷、快速的检测方法提供新思路。

1 AA常规检测技术

1.1 气相色谱(gas chromatography，GC)及其联用技术

基于GC分离的检测方法被广泛用于测定多种食品体系中的AA。因AA高极性和低挥发性，必须对其衍生化来改善稳定性和挥发性，提高检测灵敏度。我国现行标准中气相-质谱联用(GC-MS)采用稳定性同位素稀释技术检测食品AA，在试样中加入13C3-AA内标液，水作提取剂得到试样提取液，在基质固相分散萃取净化、溴试剂衍生后，用GC-MS/MS的多反应离子监测(multiple reaction monitoring, MRM)或GC-MS的选择离子监测(single ion monitor, SIM)进行检测。该方法的定量限为10 μg/kg[10]。一些新的衍生技术如呫吨氢醇作为衍生剂用于AA衍生，该方法适用于食品和水体系，所需反应条件温和，同时避免了不稳定的溴化衍生物的产生[11-12]。LUO等[13]建立了用呫吨氢醇衍生、稳定性同位素稀释的GC-MS测定煎炸、烘焙食品中AA含量的方法。该方法在试样中加入d3-AA，经提取净化，用呫吨氢醇做衍生试剂，GC-MS检测，其检出限(LOD)为0.7 μg/kg(S/N=3)，线性范围为0.005～4 μg/mL，相对标准偏差(RSD)小于6.1%，样品加标回收率在95%～112%。该方法具有灵敏度高、稳定性好、操作简便等优点，具有较高的应用价值。

1.2 液相色谱(liquid chromatography，LC)及其联用技术

AA是强极性分子，在传统反相吸附剂中的保留值低，导致基质中AA和其他的萃取物在LC中分离效果差。因此，在传统反相吸附柱中，LC与紫外检测器或二极管阵列检测器结合的选择性低，仅适用于检测AA含量高[14]，如炸薯条等加工食品。GB/T 5009.204—2014采用稳定性同位素稀释技术，以13C3标记的AA为内标溶液，水溶剂提取萃净化后，用LC-MS/MS进行检测[10]。陈子亮等[15]采用QuEChERS替代传统的固相萃取柱进行前处理，结合UHLC-MS/MS测定油炸食品中的AA。结果发现，当AA浓度为1～1 000 μg/kg时，线性关系良好(r2=0.999)，LOD为5 μg/kg(S/N=3)，加标回收率为60.2%～108.3%，RSD为1.6%～16.8%。PAOLA等[16]采用QuEChERS-LC-MS测定干果和可食用种子的AA含量，AA在较低浓度(5～25 μg/kg)时RSD为20%，较高浓度(26～124 μg/kg)时RSD为10%。此方法样品的前处理简单快速、灵敏度高、再现性好，能满足实际工作检测油炸食品中AA的需要。

2 AA新型检测技术

虽然上述标准方法具有灵敏度高、特异性好、可重复等优点，但对分析物进行萃取、衍生、净化衍生物等一系列步骤，操作复杂，相对费时，不适宜大批量样本的检测，对大型仪器的需求以及操作人员技术的要求也限制了该方法的使用。因此一些简单、便携、快速的检测方法如基于褐变的快速测定方法、酶联免疫吸附分析方法、生物传感法及荧光传感法等被相继提出并用于食品中AA含量的检测。

2.1 基于褐变的快速测定方法

美拉德反应中还原糖和天冬酰胺反应生成AA的同时伴随着颜色的变化，研究表明，褐变程度与食品中生成的AA浓度有一定的关系[17]。GÖKMEN等早期采用L*a*b*体系测定食品发生美拉德反应的颜色变化[18]，随后发现食品在加热过程中参数a*的变化与AA含量有关[19],但是该单一指标不能准确地评估表面不均匀的食品中AA的含量。GÖKMEN等又提出采用机器视觉法，通过建立褐变比率与AA浓度之间的关系来定量分析食品中的AA含量[20-21]。这种基于褐变的检测方法快速、简单、易操作、且无需对样品进行前处理，但因受光强、焦距、光圈等因素影响[22]，准确性较差，因此该方法仅适用于食品中AA含量的粗略估计。

2.2 毛细管电泳法(capillary electrophoresis，CE)

因CE分离效率和速度高，对样品和试剂量需求少，被认为是食品科学非常有用的分析工具[23]。CE是基于目标物荷质比的不同而实现高效分离的分析方法，可用于检测食品中AA含量[24]。分离物必须带电是分离的前提，但AA不带电荷，要在电场条件下实现分离，必须使其具备电荷。ZHOU等[25]首次建立了毛细血管胶束电动色谱(micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC)，在缓冲液中加入离子型的表面活性剂，使其包裹AA形成带电的胶束，通过检测该胶束实现AA的定量检测。BERMUDO等[26]建立了毛细管区带电泳(CZE)，通过柱前衍生使AA带电，在高压直流电场驱动下实现分离。BERMUDO等用2-巯基苯甲酸(2-MBA)将样品中的AA衍生化，然后采用两种在线富集模式(场放大进样(FASS)和大体积样品堆积(LVSS))的CZE与MS/MS相结合分析检测衍生后的AA，其检测结果与色谱法相比具有可比的灵敏度和精确度，可用于饼干、谷物、脆面包和咖啡等食品AA含量的分析[26-27]。此外，可将AA在低pH非水有机相(如乙腈)中进行质子化而带电，从而能在电场的作用下移动[28]。TEZCAN等[28]将FASS引入非水毛细管电泳法(nonaqueous capillary electrophoresis，NACE)中，在线浓缩AA，进一步提高了210 nm处在线紫外检测AA的灵敏度，方法的LOD值分别降至2.6 ng/mL(电动注射)和4.4 ng/mL(水动力注射)，可以快速和经济地比较不同食品加工AA的含量。EL-HADY等[29]首次采用基于离子液体的毛细管电泳(analyte focusing by ionic liquid micelle collapse capillary electrophoresis，AFILMC)测定AA，在0.05～10.0 μmol/L浓度范围内，LOD为0.71 ng/g，RSD为1.14%～3.42%(n=15)，回收率为98.0%～110.0%，该方法可对面包等食品中AA进行高效检测。

微芯片电泳方法(microchip electrophoresis, MCE)被认为是可以成功替代CE的方法，MCE除了具有CE的优点外，其所需的分析仪器可更小型化，注射样品时间短，进样量少，分离通道更短可实现更快速的分离，灵敏度高[30]。但检测食品样品中低丰度的AA，其检测限不适用，而在线富集技术提高了MCE的灵敏度[30-31]。WU等[32]采用在线多重富集技术，结合FASS和反向堆积的MCE分析薯片和薯条的AA，其LOD为1 ng/mL，RSD为2.4%～7.5%，回收率在94.7%～110.7%，其检测灵敏度与在线富集技术的CE方法相当，比未采用富集技术的CE方法提高了41～70倍，且真实食品的基质对AA的定量没有干扰。

2.3 酶联免疫分析法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)

ELISA是一种基于抗原与抗体的高特异结合，通过检测酶催化底物产生颜色反应来实现快速、简单地分析目标物的方法，已广泛用于食品检测领域。AA是小分子，缺少抗原决定簇和免疫原性，因此常将AA与具有免疫应答的载体蛋白进行交联制备完全抗原，刺激动物产生免疫反应生成AA的血清，经纯化后得到AA抗体。如付云洁[33]等采用戊二醛法合成丙烯酰胺-牛血清白蛋白(AA-BSA)免疫抗原，注入兔体内产生抗AA多克隆抗体。该检测方法准确快速、特异性强，适用于热加工食品中AA的快速检测，但可能反应效率低、易丢失抗原决定簇[34]。此外，使用活性酯如1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二甲胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)结合AA或AA类似物和载体蛋白进行交联可制备完全抗原。一些研究结果表明，在进行交联反应时，需先将AA衍生化以增加AA与载体蛋白之间连接分子的长度，使AA基团暴露，才能有效刺激动物产生抗AA或其衍生物的血清[35]。如PRESTON等[35]用3-巯基苯甲酸(3-MBA)衍生化的AA作为半抗原与载体蛋白交联制备完全抗原，免疫反应后得到AA衍生物的多克隆抗体。WANG[36]和WU等[37]也做过类似的研究，但是EDC/NHS交联法较为复杂，且会产生副产物，在实际检测AA时需现将其衍生化，这也增加了检测的时间和成本。

许多研究都是基于多克隆抗体ELISA试剂盒检测食品中的AA。但多克隆抗体是不稳定的，批次之间存在差异，可能产生大量的非特异性抗体[38]。因此ZHU[38]开发了一种基于单克隆抗体(MAb)检测AA的ELISA方法，用4-巯基苯甲酸(4-MBA)衍生化AA得到AA-4-MBA，用牛血清白蛋白(BAS)和卵清蛋白(OVA)作为载体，制备AA-4-MBA-BSA和AA-4-MBA-OVA，将其作为免疫原和包被抗原，建立了间接竞争酶联免疫吸附法(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay，icELISA)，IC50为32 ng/mL，LOD为8.87 ng/mL，检测定量的范围为8.87～112.92 ng/mL(IC20-IC80)，该法具有使用量大、通量大、分析时间短等优点。鉴于实验需要动物产生抗体，商业成本高，因此对ELISA是一个挑战性的问题，SUN等[39]开发了一种仿生酶联免疫吸附试验法(BELISA)，将亲水印迹膜作为仿生抗体，直接将其在液体环境中聚合于MaxiSorp聚苯乙烯96孔板上，该印迹膜对AA具有较高的结合能力和特异性，在不失灵敏度的情况下可重复使用20次，使得分析成本大大降低。且BELISA有较好的灵敏度(IC50，(8±0.4)mg/L)和较好的检出限(IC15，(85±4.2)μg/L)，具有较高的回收率。

总体来讲，相比传统的检测方法，ELISA法尽管在检测的灵敏度上没有优势，但其分析速度快，且不需要昂贵的仪器与复杂的样品前处理过程，对ELISA试剂盒的开发有不错的市场前景。

2.4 生物传感法

目前，一些研究集中于用血红蛋白(Hb)修饰的电极测定食品中的AA。AA可以和Hb结构中缬氨酸的α-NH2结合形成加合物，可作为感应器检测AA的含量[42]。Hb将生物传感器与电化学分析结合起来,具有灵敏度高、选择性好、响应迅速等特点,已广泛应用到分析检测中。STOBIECKA等[43]在此基础上改进了方法，将Hb和表面活性剂(DDAB)结合形成DDAB-Hb混合物，将其结合到生物传感器表面，AA与Hb反应时，其产物促进电极表面的电子转移，改变Hb的血红素Fe3+氧化还原性质，随着AA增加，Hb-Fe3+/Hb-Fe2+氧化还原的电流峰值的下降作为分析信号，可对检测液中AA定性定量分析，其LOD为1.2×10-10mol/L，可直接用于薯片等食品中AA含量测定，样品制备简单，不受基质的影响。

纳米材料的应用不仅可增加Hb在电极上的固定量，保持Hb的生物活性，还可通过增加电子转移速率来提高传感器的灵敏度[44]。KRAJEWSKA[45]等采用Hb涂覆和单壁碳纳米管(SWCNTs)修饰的玻碳电极(GCE)的伏安电化学生物传感器用于食品提取液中AA的检测。结果表明，薯片样品基质组分不会影响电极的敏感性，且在该条件下，方波伏安法(OSWV)要比循环伏安法(CV)的灵敏度更高，其LOD低至1.0×10-9mol/L。多壁碳纳米管(MWCNTs)是一种新型纳米材料，可显著提高电子转移速率，提高传感器的灵敏度。费永乐[46]将MWCNTs/Hb/(壳聚糖)Ch修饰的生物传感器用于油炸食品中AA的检测，利用差分伏安脉冲法对油炸食品中AA进行定量分析，与HPLC相比，该法具有简便、快速、准确、样品预处理简单、无需衍生化等优点。VARMIRA等[47]建立Hb-DDAB/PtAuPd纳米颗粒/Ch-IL/MWCNTs-IL/GCE的生物传感器，采用SWV测定AA，其LOD为1.0×10-13mol/L，RSD为2.9%～3.8%。后来该团队用此方法和GC-MS分别测定了炸薯条和加标样品的AA，回收率在100%左右，其精密度接近GC-MS，证实了生物传感器在实际基质中用于AA测定的可行性。

由此可见，生物传感技术具有选择性，灵敏度高、重现性好，基本不受食品体系中其他成分的干扰等特点，很适合测定食品AA含量。

2.5 荧光传感法

表1 不同检测AA方法在食品中的应用Table 1 Application of Analytical methods for detecting AA in food

注：“-”代表数据不存在。

3 总结与展望

标准方法适用于绝大多数食品(如薯片、咖啡、谷物类等)中AA的检测，灵敏度虽好，但操作繁杂费时，适用于小样本检测。而对于新型的检测技术，大多以薯片作为检测对象来判定快速检测方法的实用性，虽快速、实效但也面临着挑战，未来需要进一步改进。

对现有的CE和基于褐变的快速测定方法，其应用具有局限性，而MCE采用芯片技术，实现了分析仪器的便携化。对ELISA而言获得高特异性的生物识别元件，简化预处理过程及提高灵敏度，是其在线和实时检测食品中AA的关键问题。设计一个适合的半抗原结合AA，并在预处理期间不需要衍生化是ELISA亟待解决的问题。此外，筛选其他类型的生物受体，如对AA具有高亲和力和特异性的适配体或肽，可能为解决快速检测中识别AA的问题提供新的方法。对于生物传感法，其样品前处理步骤较ELISA相对复杂，但仍比标准方法简单，对Hb或其他生物受体在工作电极上的有效固定以及多样性和便携性的改进是检测AA的两个挑战。纳米材料如金属纳米粒子(Pt、Au、Pd等)、半导体纳米晶体(ZnO、CdSe等)、碳纳米材料(碳纳米管、石墨烯等)及其配合物与聚合物都是不错的选择，不仅能提高固定效率，也提高了检测的灵敏度、稳定性和多样性。对于荧光传感方法，目前研究较少，基于化学反应的低灵敏度和选择性是进一步研究中改进的两个关键点。

综上所述，已有的检测食品中AA的方法各有优缺点。虽然与传统方法相比，快速检测方法具有简单、便携、易操作、成本低等特点，但是这些方法需要进一步地提高精密度和准确度，简化检测和样品前处理步骤，以满足快速、实时检测食品中的AA含量的需求。