肉桂多酚对链脲佐菌素致糖尿病小鼠的保护作用

廖作庄，徐灵源，王金妮，谭宏棣，韦丽美

(1. 广西医科大学第二附属医院，广西南宁 530007；2. 右江民族医学院附属医院，广西百色 533000)

1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus, T1DM)是由于胰腺组织的β细胞自身免疫损伤导致胰岛素分泌不足或机体对胰岛素反应性降低所致的一种慢性代谢性疾病，青春期少年属于易发人群。T1DM若治疗不当或不及时，将会产生严重的并发症，进而影响患者的生活质量，甚至导致死亡。因此，保护胰岛β细胞、促进胰岛素分泌、控制血糖对治疗和预防糖尿病具有极其重要的意义[1]。在临床实践中，化学药物和胰岛素注射是常见的抗T1DM治疗方案，但因产生的耐药性和难以控制的副作用限制了其长期使用。因此，长效低毒的替代药品亟待开发。传统中药是以中医药理论为指导，应用于防治相关疾病的天然药物及其制品，因其具有独特的疗效和低副作用而得到应用与开发[2]。

肉桂又称阴香、天竺桂、细叶香桂等，是樟科植物肉桂的干燥树皮，具有补火助阳、散热止痛、温通经脉的功效，是广西的地道药材，也是一种常用的食品香料或烹饪调料。肉桂中含有肉桂醛、肉桂酸、多酚类、黄酮类和香豆素等活性成分，具有降糖、调脂、改善胰岛素抵抗、扩血管及抗血小板聚集等作用。肉桂多酚是肉桂的活性成分之一，包括多种儿茶素、表儿茶素类单体化合物及其糖苷[3]。药物化学分析和药理学研究发现，肉桂中含有的黄烷醇等活性多酚类抗氧化物质，具有稳定血糖、降低胰岛素抵抗及增强胰岛素的活性[4]。本课题组前期研究表明，肉桂多酚通过修复糖尿病小鼠胰腺β细胞数量而发挥降血糖作用[5]。然而，肉桂多酚促进胰岛素分泌的分子机制尚未明了。研究表明，活化的AKT通过磷酸化多种酶、激酶和转录因子等下游因子，进而调节细胞的功能和葡萄糖的代谢[6]。本实验通过建立链脲佐菌素(STZ)致糖尿病小鼠模型，观察肉桂多酚对STZ致糖尿病小鼠胰岛细胞的保护作用并探讨其分子机制，为寻找治疗和预防T1DM的新靶点和新药物奠定基础。

1 材料

1.1 实验动物 雄性SPF级昆明小鼠，6～7周龄，体质量(25±2)g，购自广西医科大学实验动物中心，动物许可证号：SCXK桂2009-0002。适应性饲养1周后，开展相关动物实验。

1.2 药物与试剂 STZ(美国Sigma-Aldrich公司，批号9008201612)，盐酸二甲双胍片(郑州泰丰制药有限公司，批号20174087)，血糖测试条(艾康生物技术(杭州)有限公司，批号 2016047)，C反应蛋白和胰淀粉酶试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号 2017023、2017068)，小鼠胰岛素和胰高血糖素ELISA试剂盒(艾莱萨生物科技(上海)有限公司，批号 2017013、2017018)，SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，碧云天生物技术有限公司，批号WB1208)，AKT多克隆抗体(美国Santa Cruz Biotechnology，批号SC-1259)，山羊抗兔IgG-HRP抗体(碧云天生物技术有限公司，批号20170436)，预染蛋白Marker(北京索莱宝科技有限公司，批号1204762)。

1.3 仪器 5810R高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)，722S紫外分光光度计(北京精密科学仪器有限责任公司)，FZG-15型多用途烘箱(贵阳新奇微波工业有限责任公司)，Mini-PROTEAN垂直电泳仪、转膜及显影设备(美国BIO-RAD公司)，iMark酶免分析仪(美国BIO-RAD公司)，CX41正置光学显微镜(日本奥林巴斯公司)。

1.4 方法

1.4.1 制备肉桂多酚[5]肉桂经右江民族医学院附属医院刘春荣副主任中药师考证为樟科植物肉桂的干燥树皮。500 g粉末用4 500 mL 700 mL/L乙醇(1∶10；m/V)萃取3次，并加热回流(80 ℃)2 h。将粗提物浓缩，悬浮于蒸馏水中并分离，依次为氯仿(1∶8；V/V)和正丁醇(1∶4；V/V)。对正丁醇中的萃取液在旋转蒸发器中在60 ℃下蒸发，合并萃取液。经过Folin-Ciocaheu验证方法，鉴定肉桂多酚提取物的终产物为45.96 g(9.215%，W/W)。

1.4.2 建立STZ糖尿病小鼠模型 经血检排除自发高血糖小鼠，并在造模前禁食12 h，经腹腔注射新鲜配制的STZ溶液(240 mg/kg)。待48 h后，尾静脉采血测空腹血糖(FBG)值，并选取FBG≥11.1 mol/L的小鼠认定为T1DM小鼠[5]。

1.4.3 给药方案 对选取的STZ糖尿病小鼠进行随机分组(n=10)：糖尿病对照组、二甲双胍阳性组(0.3 g/kg)及肉桂多酚低、中、高剂量组(0.3、0.6、1.2 g/kg)。同时，设置正常对照组(n=10)。使用剂量参照有关文献制定[5]，每天灌胃给予肉桂多酚，正常对照组和模型对照组给予等量双蒸水，持续灌胃至14 d。

1.4.4 生化指标检测 末次给药后，血糖试纸测定FBG值，生化法测定血清中胰淀粉酶含量，酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定血清中胰岛素和胰高血糖素浓度。所有实验步骤均按照厂家附件说明书严格操作。

1.4.5 免疫组化法检测胰岛素阳性细胞 石蜡包埋的胰腺组织制备成5 μm切片，经二甲苯脱蜡梯度乙醇脱水后，50 g/L牛血清白蛋白(BSA)封闭1 h后，用稀释的兔抗胰岛素(1∶200，博士德生物，批号P35568)4 ℃过夜孵育。切片经清洗后，经即用型SABC-POD(小鼠/兔IgG)(博士德生物，批号SA1020)试剂盒进行二抗孵育和二氨基联苯胺(DAB)染色，苏木素核复染。选取5个不重复的视野计算胰岛素阳性细胞数量，进行数据分析。

1.4.6 蛋白免疫印迹(Western blot)法检测AKT及其磷酸化水平 取新鲜胰腺组织分离蛋白，经BCA法测定蛋白浓度。每组40 μg蛋白上样，经100 g/L聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白，转移蛋白至PVDF膜。50 g/L脱脂奶粉封闭1 h，用稀释的兔抗AKT、AKTser473、GAPDH(1∶1 000，博士德生物，批号A00024、BM4838、A00227)4 ℃过夜孵育。洗涤后，使用HRP标记的二抗对膜进行显色。条带成像和数据分析使用伯乐公司的凝胶成像系统SYSTEM GelDoc XR+完成。

2 结 果

2.1 肉桂多酚对STZ糖尿病小鼠血糖和胰淀粉酶浓度的影响 实验结果显示，与正常对照小鼠比较，STZ致糖尿病小鼠血糖(FBG)显著上升(P<0.05)，同时血清胰淀粉酶含量明显增加(P<0.05)。经二甲双胍和肉桂多酚干预14 d后，小鼠FBG水平与STZ致糖尿病小鼠比较有了明显的降低(P<0.05)，同时血清中胰淀粉酶浓度降低(P<0.05)，且表现出一定的剂量关系(表1)。

表1 肉桂多酚对STZ糖尿病小鼠血糖和胰淀粉酶浓度的影响

与正常对照组比较，*P<0.05；与STZ模型组比较，#P<0.05。

2.2 肉桂多酚对STZ糖尿病小鼠血清胰岛素和胰高血糖素浓度的影响 ELISA实验结果显示，与正常对照小鼠比较，STZ致糖尿病小鼠血清中胰岛素显著降低(P<0.05)，同时血清中胰高血糖素浓度明显增加(P<0.05)。经二甲双胍和肉桂多酚干预14 d后，与STZ致糖尿病小鼠比较，小鼠血清中胰岛素水平有了明显增加(P<0.05)，同时血清中胰高血糖素浓度降低(P<0.05)，表现出一定的剂量依赖性(图1)。

图1 肉桂多酚对STZ糖尿病小鼠血清胰岛素和胰高血糖素浓度的影响

与正常对照组比较，*P<0.05；与STZ模型组比较，#P<0.05。

2.3 肉桂多酚对STZ糖尿病小鼠胰岛细胞中胰岛素阳性细胞数量的影响 免疫组化分析表明，与正常对照组比较，STZ糖尿病小鼠胰岛组织中胰岛素阳性细胞数量显著减少，差异有统计学意义(P<0.05)。经二甲双胍和肉桂多酚干预14 d后，胰岛组织中胰岛素阳性细胞数量显著增加，与STZ组比较，差异有统计学意义(P<0.05，图2)。

图2 肉桂多酚对STZ胰岛细胞中胰岛素阳性细胞计数的影响

与正常对照组比较，*P<0.05；与STZ模型组比较，#P<0.05。

2.4 肉桂多酚对STZ糖尿病小鼠胰腺细胞中AKT蛋白及其磷酸化水平的影响 Western blot分析表明，与正常对照组比较，STZ糖尿病小鼠胰腺组织中AKT蛋白及其磷酸化水平明显下调，差异有统计学意义(P<0.05)。经二甲双胍和肉桂多酚干预14 d后，胰腺组织中AKT蛋白及其磷酸化水平明显上调，与STZ组比较，差别有统计学意义(P<0.05，图3)。

图3 肉桂多酚对STZ胰腺细胞中AKT蛋白及其磷酸化水平的影响

与正常对照组比较，*P<0.05 ；与STZ模型组比较，#P<0.05。

3 讨 论

糖尿病是一种长期存在高血糖水平的代谢性疾病，如果得不到及时治疗，可引起许多并发症，如酮症酸中毒、慢性肾衰竭、足部溃疡和眼睛失明等[7-8]。其中T1DM导致胰腺衰竭，产生病理性胰岛素分泌不足[9]。临床上，最常用的是胰岛素注射或化学药物治疗，但都因其具有较大的副作用而限制了长期用药。中药降糖作用具有多靶点、多向性、多途径，且作用温和持久，并能延缓并发症发生等优点。因此，开发中药活性成分的抗糖尿病作用是当前的潜在干预策略之一。

基础数据分析表明，STZ糖尿病小鼠空腹血糖和胰淀粉酶水平均明显增加，提示STZ对胰腺细胞具有靶向毒性作用。二甲双胍组和肉桂多酚组干预14 d后，小鼠血糖(FBG)水平与STZ致糖尿病小鼠比较有了明显的降低，同时血清中胰淀粉酶浓度降低，且表现出一定的剂量依赖性，表明肉桂多酚具有明显的降血糖效应。

胰岛素是由胰岛β细胞产生的肽激素，调节碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢，在糖尿病的发生发展中具有关键的调控作用[10]。本研究发现，经二甲双胍和肉桂多酚干预后的STZ糖尿病小鼠血清胰岛素水平逐渐升高，且表现为一定的剂量依赖性。此外，胰岛组织中的胰岛素阳性细胞数量在肉桂多酚干预下也逐渐增加，提示促进胰岛细胞分泌胰岛素是肉桂多酚抗糖尿病活性的直接药理活性之一。

蛋白激酶B(AKT)是丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，其在多种细胞的生理过程如葡萄糖代谢、凋亡、细胞增殖、转录和细胞迁移中起关键作用。AKT是胰岛素诱导的葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)向质膜易位所必需的。 此外，糖原合成酶激酶3(GSK-3)可被AKT磷酸化抑制，导致糖原合成增加[11]。因此，激活胰腺细胞中AKT信号通路有助于调节机体糖代谢稳态和胰岛细胞生长。本研究结果显示，经二甲双胍和肉桂多酚干预后的STZ糖尿病小鼠胰岛组织中的AKT及其磷酸化水平明显上调，且表现出一定的剂量依赖性，提示诱导胰岛细胞AKT调控因子表达是肉桂多酚抗糖尿病的分子作用机制之一。

综上所述，我们推测肉桂多酚的降血糖药理活性与激活胰岛细胞中的AKT通路有关，从而刺激胰岛素分泌发挥具抗糖尿病生物活性。