超声波预处理半纤维素酶和纤维素酶对黍子谷壳酶解效果的影响

◎ 额日赫木，邓慧清，杨亚萍，张 琪，宋小青

（山西师范大学食品科学学院农产品加工与贮藏实验室，山西 临汾 041004）

黍子是中国北方干旱或半干旱地区的主要粮食作物之一，也是中国独具特色的杂粮作物之一[1-3]。我国是世界上黍子栽培面积最大的国家，种植面积约为10 000 km2，在北方（西北、华北、东北等）山区均有种植，资源丰富[4]。黍子果实为颖果，脱皮后可食用，其富含蛋白质、淀粉、脂肪、维生素和矿物质，近年来的一些研究表明，黍子中含有丰富的具有降血糖、降血脂、抗氧化等功能的天然活性物质，如酚类物质、植酸、生物碱等[5]。随着人们对黍子的认可度的提高和食品精加工技术的提高，黍子加工产业也得到了较好的发展。然而，加工过程中产生的谷壳部分除了用于饲料生产外，多处于废弃状态，这不仅浪费了资源，而且会造成环境的污染[6]。黍子谷壳占其果实总质量的20%左右[7]，其中含有丰富的纤维素、半纤维素等成分，具有较高的利用价值[8]。因此，提高黍子谷壳的综合利用率，将对我国杂粮产业发展具有积极推动作用。

超声波是频率范围为1.6×104～1.6×109Hz的声波，属于机械波的一种。它作为一种物理能量形式和辅助加工方法，被广泛应用于提取、乳化、杀菌、检测、加工等食品工业及食品酶类的研究中均得到了广泛的应用[9-10]。空化效应、热效应和机械作用是超声波技术应用的理论依据。其中，空化效应被认为是最重要的理论依据，其可以导致充气气泡的产生及微射流的出现[11]。一些研究发现，超声波处理可以改变酶类分子空间构象，使其活性随之发生改变。它通过对介质的空化作用，机械作用和超声混合效应使分子之间的相互作用力（氢键、疏水相互作用、范德华力等）发生改变，使更多的反应中心形成与暴露，有利于不同分子间的相互作用[12-15]。基于此，本研究试图利用超声波技术提高半纤维素酶和纤维素酶的活性，继而提高其对黍子谷壳的酶解效率。首先筛选出半纤维素酶和纤维素酶的最佳酶解条件；然后考察超声波预处理半纤维素酶和纤维素酶对酶解黍子谷壳的能力。将黍子谷壳中的半纤维素和纤维素尽可能转化为可被利用的分子量小的糖分子，为黍子谷壳中生物活性多糖的提取利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 样品的制备

黍子（晋黍8号）谷壳购自山西省山阴县，将黍子谷壳用流水反复冲洗数次（除去淀粉等物质）。经蒸馏水再次进行洗净3次，得到残渣，再将残渣置于鼓风干燥箱中烘干（75 ℃，15 h）至恒重。将干物质样品粉碎，过筛（100目），后再次干燥至恒重，装入密封袋后置于干燥器中备用。

1.1.2 试剂

分析纯（氢氧化钠、丙三醇、冰乙酸、无水乙酸钠、葡萄糖）南京化学试剂股份有限公司；3-5二硝基水杨酸（化学纯）上海弘顺生物科技有限公司；纤维素酶（食品级，活性2 000 U·g-1）、半纤维素酶（食品级，活性2 000 U·g-1）上海宝丰生化有限公司。

1.1.3 仪器

DZF-6050真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）、DZKW-D-4电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）、FS-1200N超声波处理器（上海生析超声波有限公司）、pH-25数显pH计（上海仪电科学仪器有限公司）、752型紫外分光可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的配制

（1）黍子谷壳溶液的配制。准确称取1.01 g的上述干燥黍子谷壳样品，移入100 mL的烧杯中，加入50 mL缓冲溶液进行搅拌溶解，再将其移入到100 mL容量瓶中定容到刻度，得到1%的样品溶液备用。

（2）酶溶液的配制。分别称取100 mg的纤维素酶和半纤维素酶，移入100 mL的烧杯中，加入25 mL缓冲溶液进行搅拌溶解，再将其移入100 mL容量瓶中定容到刻度，得到0.1%的酶溶液4 ℃条件下冷藏备用。

（3）乙酸-乙酸钠缓冲溶液的配制。量取11.55 mL冰乙酸定容至1 000 mL容量瓶中，即得到0.2 moL·L-1的乙酸溶液；称取16.4 g无水乙酸钠溶于蒸馏水后定容至1 000 mL容量瓶中，即得0.2 moL·L-1的乙酸钠溶液。由此分别配制不同pH值的乙酸-乙酸钠缓冲溶液。

（4）DNS试剂的配制。参照巩莉等[16]的研究并加以改动。准确称取3.25 g的3,5-二硝基水杨酸用蒸馏水充分溶解待用。称取20 g氢氧化钠用蒸馏水充分溶解，冷却后移入250 mL容量瓶（2 moL·L-1），定容备用。将上述水杨酸溶液移入500 mL容量瓶，并加入162.5 mL的氢氧化钠溶液，再加入7.5 mL丙三醇溶液充分溶解后定容至500 mL，移入棕色试剂瓶中4 ℃贮存待用。

1.2.2 实验设计

1.2.2.1 酶解条件的筛选

确定半纤维素酶和纤维素酶的最佳pH值、水浴温度、水浴时间等酶解条件，实验设计见表1。

表1 酶解条件的设计表（n=5）

1.2.2.2 超声波预处理条件的筛选

将150 mL 0.1%的半纤维素酶或纤维素酶溶液移入200 mL烧杯中，置于超声处理装置内（见图1），使变幅杆探头置于1 cm酶溶液深度，仪器固定频率为20 kHz，变幅杆直径为20 mm。对半纤维素酶和纤维素酶进行超声波处理，设定超声处理条件：①固定超声时间为25 min，超声功率分别设为0、120、240、360、480 W和600 W。②固定超声功率为360 W，超声时间分别设为 0、2、4、6、8 min和10 min。从而考察超声功率和时间对半纤维素酶或纤维素酶活性的影响。

图1 超声处理系统示意图

1.2.2.3 半纤维素酶和纤维素酶活性在不同贮存时间内的变化

在相同的超声处理条件下，分别对纤维素酶和半纤维素酶进行超声处理，考察两种酶在不同放置时间，即0、2.5、5、7.5、10、12.5 h和15 h时的酶活性变化。

1.2.2.4 葡萄糖标准曲线的制作

准确称取0.5 g葡萄糖，充分溶后定容至500 mL容量瓶中（1 mg·mL-1)备用，标准曲线是参照赵凯等[17]的研究并加以改动，绘制出的吸光值-葡萄糖浓度曲线，见图2。

以葡萄糖的吸光值为y轴，以其浓度为x轴，进行线性回归，并求得线性回归方程为y=0.81x-0.0117，R2=0.996 6。

图2 葡萄糖标准曲线图

1.2.2.5 酶活性的测定

参照谢现英[18]的研究并适当加以改动来测定半纤维素酶和纤维素酶活性；通过测定分解黍子谷壳产生的还原糖（葡萄糖计）含量，再将其换算为酶活性。将1 mL的1%的黍子谷壳残渣溶液移入10 mL刻度试管中，加入0.5 mL、0.1%的酶溶液，置于水浴锅中加热反应，再加入1 mL的DNS试剂，置于沸水浴中加热15 min灭酶。待冷却至室温后，定容至10 mL，在波长540 nm处测定其吸光值。空白对照加入1 mL、1%的黍子谷壳废渣溶液，再加入0.5 mL蒸馏水，其他条件均不变。

1.2.3 统计学方法

各组循环处理5次，取平均值，采用Excel 2007进行统计分析，利用SPSS 20.0软件分析数据，数据以（x-±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以p＜0.05为差异显著，有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 酶解条件的筛选

如图3所示，当反应体系中酶解pH值为4～6，半纤维素酶酶解黍子谷壳残渣所得的葡萄糖浓度值呈现先升高后下降的趋势；当pH值为5.0时，浓度显示最高值（0.39 mg·mL-1），且pH为5.5与5.0相比，并无显著性差异（p＞0.05）。因此，半纤维素酶的最佳酶解pH为5.0～5.5。纤维素酶在酶解pH值为5.5和6.0时，其分解黍子谷壳残渣所得的葡萄糖浓度显示最高值（分别为0.279和0.280 mg·mL-1），而且两者并无显著性差异（p＞0.05）。提示环境pH值的变化会改变酶分子的结构（官能团的变化）或空间构象，pH值过大或过小将会导致酶活性升高或降低，从而使酶解率随之发生改变[19]，因此选择适当的pH环境对酶解反应尤为重要。故选取pH为5.0和5.5分别作为半纤维素酶和纤维素酶的酶解反应最佳pH值，在此条件下，酶与底物相互结合，并产生最高催化作用，有利于酶促反应的快速进行。

图3 不同pH值对葡萄糖浓度的影响图（n=5）

如图4所示，随着水浴时间的延长，两种酶酶解黍子谷壳残渣所得的葡萄糖浓度值都出现先上升后下降的趋势，当水浴时间为15 min时，葡萄糖浓度达到最大值，即半纤维素为0.358 mg·mL-1、纤维素酶为0.276 mg·mL-1。然而，这与水浴时间为25 min时相比，并无显著性差异（p＞0.05）。当反应时间大于25 min时，其葡萄糖浓度明显降低，这可能由于加热时间过长而可能导致两种酶的分子结构（如氢键断裂）发生改变，继而使其活性随之降低。故半纤维素酶和纤维素酶最佳水浴时间都为15～25 min。从节能的角度考虑，两种酶的水浴时间可确定为15 min。

图4 不同水浴时间对葡萄糖浓度的影响图（n=5)

如图5所示，当水浴温度为50 ℃时，半纤维素酶酶解黍子谷壳残渣所得的葡萄糖浓度显示最大值（0.379 mg·mL-1）。但其与水浴温度为40 ℃时相比较，两者间并无显著性差异（p＞0.05）。然而杨立霞[20]的研究表明，3种纤维素酶即木聚糖酶、甘露聚糖酶和α-葡萄糖苷酶的最佳反应温度均为50 ℃。裴建军等[21]研究发现，半纤维素酶系主要是由木聚糖诱导，而木聚糖酶的最适反应温度为60 ℃。由此可见，不同种类的半纤维素酶，其最适反应温度有所不同，当半纤维素酶处于混合时，其最适反应温度与单一的酶相比可能发生不同程度的改变。故半纤维素酶最佳水浴温度范围可确定为40～50 ℃。在相同的水浴温度范围内，纤维素酶酶解黍子谷壳残渣所得的葡萄糖浓度，在60 ℃时显示最大值（0.282 mg·mL-1）。但这与水浴温度为40和50 ℃时相比，并无显著性差异（p＞0.05）。相关研究如秦广利等[22]表明，纤维素酶在酶解温度为56 ℃的条件下，水解酒糟不溶性纤维素产生可溶性糖的含量最高。李妍等[23]研究表明，酶解温度为55 ℃时，对纤维素酶的处理能够改善粉葛糖化的效果。由此可见，纤维素酶的酶解温度为40～60 ℃时，显示较高的酶活性，并取决于酶解pH值、温度等因素的变化。由于高温水浴会消耗较多的能量，故选择40 ℃作为半纤维素酶和纤维素酶的酶解温度较为合理。

图5 不同水浴温度对葡萄糖浓度的影响图（n=5)

综上所述，当pH值为5.0、水浴温度为40 ℃、水浴时间为15 min时，可作为半纤维素酶的最佳酶解条件。当pH值为5.5、水浴温度为40 ℃、水浴时间为15 min时，可作为纤维素酶的最佳酶解条件。通过对两种水解酶最佳酶解条件的确定，为超声波处理的实施奠定了基础。

2.2 超声波预处理条件的筛选

如图6所示，半纤维素酶在超声功率为480 W时，其酶活性显示最大值（528.27 mg·g-1·min-1），与未超声处理相比，其酶活性提高了25%，两者之间差异有统计学意义（p＜0.05）。然而，超声功率为480～600 W时，其酶活性并无显著性差异（p＞0.05）。纤维素酶在超声功率为120 W时，其酶活性显示最大值（528.27 mg·g-1·min-1），与未超声处理相比，其酶活性提高了25%，两者之间差异有统计学意义（p＜0.05）。覃益民等[24]的研究表明，β-果糖基转移酶在20 kHz、300 W功率下超声处理5 min，与未超声处理相比其活性提高了12%。许可等[25]的研究表明，海芋过氧化酶在超声功率为25 W、频率为13.5 kHz、超声时间为4 min时，这与原酶液相比，其酶活性降低了36.2%。说明不同的酶类在不同的超声功率下，其酶活性产生的影响也不同。在适当的处理条件下，超声波可能改变酶类分子结构（如空间结构）从而导致其活性发生改变。

图6 超声功率对半纤维素酶和纤维素酶活性的影响图（n=5）

由图7可知，当超声处理时间为6 min时，半纤维素酶活性达到最大值，即495.71 mg·g-1·min-1，与未处理相比，其活性显著提高了14.73%，差异有统计学意义（p＜0.05）。然而在2～8 min，半纤维素酶活性并无显著性差异（p＞0.05）。在同样条件下，纤维素酶在超声处理6 min时达到最高活性，即309.64 mg·g-1·min-1，与未处理相比较，其活性显著提高了14.27%，差异有统计学意义（p＜0.05）。然而半纤维素酶活性在2 min和4 min时，差异无统计学意义（p＞0.05）。黄六容等[26]的研究表明，木瓜蛋白酶在超声功率为40 W，超声处理时间为5 min时，木瓜蛋白酶活性达到最高值，其与未超声处理相比其活性提高了9%，差异有统计学意义（p＜0.05）。而石文奇等[27]的研究表明，当超声功率为80 W，超声处理时间为4 min时，α-淀粉酶显示最高活性。由此可知，在适当的超声处理时间内可以提高水解酶类活性。因此，半纤维素酶和纤维素酶的最佳超声时间为4～6 min。从节能角度考虑，应选用4 min。

图7 超声时间对半纤维素酶和纤维素酶活性的影响图（n=5)

2.3 半纤维素酶和纤维素酶活性在不同贮存时间内的变化

由图8可知，超声处理和未经处理的半纤维素酶和纤维素酶，随着放置时间的延长，其活性均不断下降。放置时间在0～5 h内，经超声处理的两种酶均能保持较高的活性，半纤维素酶活性为491.69～502.48 mg·g-1·min-1，纤维素酶活性为 283.31 ～ 298.81 mg·g-1·min-1，且二者差异无统计学意义（p＞0.05)。这与未经超声处理的半纤维素酶和纤维素酶相比，分别多保持了4.5%～10%和7.3%～8.7%的酶活性。关于酶活性随时间的变化，谢晓丽[28]的研究表明，超声处理后的纤维素酶在放置10 h后，各个样品的酶活力有显著降低，而经过48 h后酶活力降至低于原酶活力，甚至28 kHz处理下的样品酶活性比原酶活性降低了68.97%。石文奇等[27]发现，α-淀粉酶随放置时间的延长（0～60 min）而其活性也出现了不同程度的降低。由此可见，在一定的条件下，酶类活性随着放置时间的延长而降低。在酶解反应之前对半纤维素酶和纤维素酶进行处理，不仅能提高其活性，而且可使其在一定时间内可以保持较高的活性。因此，放置时间在5 h内，经超声波处理后的两种水解酶，与未经超声处理的样品相比较均可保持较高的活性，对黍子谷壳具有较好的酶解能力。

图8 不同贮存时间对半纤维素酶活性的影响图（n=5）

综上所述，半纤维素酶和纤维素酶在超声功率分别为480 W和120 W，超声时间为4 min时，其酶活性显示最大值。经超声波处理后的两种酶，在0～5 h放置时间内，其与未处理相比仍然保持了较高的酶活性且差异明显（p＜0.05）。

3 结论

实验结果表明，半纤维素酶和纤维素酶的最佳酶解条件分别是：pH值为5.0和5.5，水浴温度均为40 ℃，水浴时间均为15 min。超声处理半纤维素酶和纤维素酶的最佳条件分别是：超声功率为480 W和120 W，超声时间均为4 min。在此条件下，半纤维素酶和纤维素酶分别可将黍子谷壳中的半纤维素和纤维素最大限度的转化为可被利用的糖类分子。同时，在0～5 h的放置时间内，超声处理后的两种酶与未处理时相比均可保持了较高的酶活性。本研究为黍子谷壳的综合开发利用提供了新的思路和理论依据，也使超声波技术在食品酶类研究中的应用得到了拓展。