大豆油DNA提取及检测研究进展

夏义苗 陈复生 郝莉花 张丽芬 辛 颖

（河南工业大学粮油食品学院 郑州 450001）

植物油能为人体正常新陈代谢提供必需脂肪酸、脂溶性维生素、酚类等有益物质[1]，作为良好的烹饪媒介，是人们日常生活中不可或缺的重要组成部分。2018年全球共种植大豆约12 295万hm2，其中78%为具有除草剂抗性的转基因大豆[2]，大豆油产量仅次于棕榈油，是世界第一大食品用植物油[3]。我国进口大豆主要来源于美国、巴西和阿根廷等这些转基因大豆种植大国[4-5]。由于我国农村农业部规定转基因大豆禁止直接用于人体可食用蛋白的加工，因此进口大豆几乎均被用于大豆油的生产，2018年我国大豆进口约8 300万t，自产大豆约1 590万t，相应大豆油消费量高达约1 588 万 t，远高于菜籽油（约 830 万 t）、棕榈油（约451 万 t）和花生油（约 302 万 t）等[2]，转基因大豆油在我国植物用油中排首位。

随着民众对转基因大豆油关注度的持续高涨，我国相关政府部门对转基因产品标识制度的建立和完善也愈加重视，科学完善的标识制度不仅有助于促进大豆油市场健康有序的发展，亦可使消费者的知情权和自主选择权得以保障[6-7]。标识制度的顺利执行依赖于对相关转基因食品精准的检测手段，不同的化学方法（同位素标记、光谱、色谱等）和生物方法（DNA检测等）均被大量尝试应用于食用油的品质鉴定、溯源或转基因检测中，而油料作物的栽培地点、气候和环境等因素的变化均会显著改变油籽的化学成分组成，这使得基于化学方法的食用油检测技术难以获取用于区分的临界值，且灵敏度有限[8-10]。而DNA检测方法如PCR、real-time PCR等灵敏度高，特异性好，正在越来越广泛地被应用于食用油的掺伪、溯源及转基因检测中[11-12]。近年来我国亦陆续出台了多项标准、法规来引导DNA检测技术在大豆油转基因成分监测中的应用[13-16]。

DNA本身属于水溶性分子，复杂的油脂精炼工艺、储存过程、油脂氧化作用、核酸酶的存在等均会在不同程度上破坏DNA结构[17-18]，被提取DNA中的蛋白、多酚、油脂或色素等残留亦会抑制PCR等反应[19-20]。为了提高被提取DNA的纯度和数量，保障后续PCR等试验顺利开展，预防假阴性检测结果的出现，本研究对国内外报道的大豆油DNA提取方法进行比较分析，将其有益经验进行总结，以期促进DNA检测技术更好地服务于大豆油转基因监测工作，为政府标识制度的完善和实施提供参考。

1 大豆油DNA提取方法

1.1 DNA水相浓缩

DNA属于水溶性分子，因此往往需要向大豆油中加入水相，通过混合，使DNA分子进入水相，将水油分离后针对水相进行后续DNA纯化操作。大豆油与水相在混匀过程中会发生严重的乳化现象，使得水油分界面出现大量白色固体物，这将阻碍水油分离，也极易造成目标DNA损失，因此部分研究者选择在水油混匀过程中加入可与油相互溶的有机试剂，来促进水油分离，这在水油二相总量较大的情况下应用较普遍，当大豆油和水相总体积小于2 mL，二者在2 mL离心管中进行混匀、离心操作时，没有有机试剂的参与水油两相亦可分离良好。亦有研究者如Costa等[18]直接取200 g精炼大豆油在18 000×g、4℃下离心30 min，取离心所得沉淀进行后续DNA纯化试验。

水相提取液种类众多，既有十六烷基三甲基溴化铵（Cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）、十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）、Nuclei lysis solution（Wizard试剂盒）和异硫氰酸胍等裂解液，也有适于溶解DNA的无菌水、TE或磷酸盐缓冲溶液（Phosphate buffer saline，PBS）等。依据文献报道，裂解液可直接与油相混合进行DNA提取，亦可在水或TE溶液与油相混合、离心后，被加入到水相中进行后续试验；无菌水、TE或PBS溶液与大豆油混匀离心后的水相可直接进行后续试验。裂解液的参与往往伴随高温如65℃水浴，而无菌水、TE或PBS溶液则不需要。

不同裂解液对大豆油DNA提取效率不一，闻伟刚等[21]比较了 2%CTAB、0.5%SDS、Nuclei lysis solution（Wizard试剂盒）和异硫氰酸胍裂解液从大豆油中提取DNA效率，结果发现异硫氰酸胍裂解液与大豆油混溶，因而不适合大豆油DNA的提取，而其它3种裂解液效果相仿，均可从大豆原油中提取出DNA，而一级精炼大豆油PCR结果均呈现阴性；许冬倩等[22]比较了2%CTAB和20%SDS提取液对一级精炼大豆油DNA提取的适用性，结果显示20%SDS裂解液提取的DNA可扩增出35S 200 bp基因片段，而2%CTAB提取结果呈阴性，由此可知20%SDS裂解液对精炼大豆油DNA的提取效果优于2%CTAB；He等[20]分别利用TE，2%CTAB，5%CTAB和1.4 mol/LNaCl溶液作为水相从精炼大豆油中提取DNA，结果发现2%CTAB溶液参与提取DNA后Lectin 118 bp片段PCR扩增呈阴性，其它3种均呈阳性，而TE参与提取的DNA扩增信号较弱，5%CTAB和1.4 mol/L NaCl溶液相应扩增信号均较强。由此可知，作为精炼大豆油水相提取液2%CTAB和0.5%SDS效果相仿，TE溶液较之更好，然而均不如5%CTAB，20%SDS和1.4 mol/L NaCl溶液适用性好，不难发现适当提高裂解液中表面活性剂浓度有利于精炼大豆油DNA的提取。

文献报道中起始用油量差别较大，用量在1～500mL 不等[18，19，23]。 Bogani等[24]指出起始物料用量越大，越利于DNA的提取。周红霞等[25]建议将精炼大豆油量增加至20 mL来满足后续PCR检测所需的DNA量。王澎等[26]将200 mL一级精炼大豆油和20 mL TE混合提取DNA，成功获取Lectin 475 bp的目标片段，巢式PCR可扩增出EPSPS 110 bp和316 bp片段，而许冬倩等[22]用20 mL油和400 μL TE混合，又借助于20%SDS裂解作用，最终只从一级精炼大豆油中扩增出200 bp的产物，由此可知起始油消耗量与终产品目标DNA片段长度具有正相关性，而这一结论也在He等[20]研究中得以证实。

用于降低水油混合过程中乳化作用，促进水油分离的有机试剂主要有氯仿[24]、正己烷[23]、正庚烷[27]等。有机试剂可同时与大豆油、水相提取液混合，亦可先与大豆油混匀，再与水相提取液混合。He等[20]比较了正己烷、正庚烷和氯仿在精炼大豆油DNA提取中的适用性，结果发现不同种有机试剂参与均可成功检测到被提取DNA Lectin 118 bp扩增片段，而氯仿作用下的扩增片段信号最强，且氯仿参与后混合液水油分离效果最好，因此作者推荐氯仿作为精炼大豆油DNA提取过程首选有机试剂。Bogani等[24]在用Wizard Magnetic DNA Purification System for Food Kit从大豆毛油和脱胶油中提取DNA时，亦选用氯仿替代试剂盒推荐有机试剂正己烷来提高被提取DNA纯度。

大豆油、水相和有机试剂比例亦会影响大豆油中DNA的提取效率。油与TE混合，使用最普遍的体积比是5∶2，随后TE水相与CTAB裂解液体积比1∶1居多，与20%SDS裂解液体积比多为8 ∶1[22，25，28]。 食用油与有机试剂先混匀再与水相提取液混合时，农业部1485号公告-4-2010关于油脂类加工品DNA提取方法将正己烷与食用油以及水油体积比均设置为5∶6。He等[20]研究亦发现氯仿和食用油体积比接近1时DNA提取效果最好，具体到大豆油最佳体积比建议调整为5∶7，同时水油体积比建议值为5∶6。

1.2 DNA纯化

1.2.1 水相直接沉淀法 大豆油中DNA被转移入TE溶液后，可氯仿抽提，接着向上清液中加入异丙醇或无水乙醇沉淀DNA[26]，若此时DNA中油脂蛋白残留量较多，可氯仿二次抽提，再加入异丙醇或乙醇沉淀[28]。若水相提取液使用PBS缓冲液，则需向水相提取液中加入硫酸铵溶液沉淀DNA[23]。

1.2.2 裂解液法 加热后的CTAB或SDS裂解液均可用酚氯仿（体积比，1∶1）或氯仿异戊醇（体积比，24∶1）混合液进行抽提，去除水相中蛋白质等杂质，抽提后的上清液可直接加入0.6倍体积异丙醇使DNA沉淀[22]。对于CTAB裂解液来说，亦可向水相提取液中加入DNA沉淀液（0.04 mol/L NaCl），使DNA沉淀分离出来，再利用1.2 mol/L NaCl复溶DNA，随后加入氯仿抽提，抽提后的上清液借助于0.6倍体积异丙醇沉淀出DNA[29]。如果裂解液是SDS提取液，则可向水相提取液中加入5 mol/L醋酸钾溶液，冰浴30 min后离心取上清，加入异丙醇或无水乙醇沉淀DNA[22]。

CTAB法虽然较适合深加工食品DNA的提取[19，29]，但该法对试验者操作水平要求较高，如Nikolic等[30]指出CTAB法提取DNA结果随机误差较大，提高操作者熟练程度，避免过多样品同时进行DNA提取，可大大降低由操作带来的随机误差。Ramos等[19]试验发现向CTAB裂解液中加入Tween20、蛋白酶K或PVP、β-巯基乙醇可提高被提取DNA纯度，以利于后续进行real-time PCR试验；延长65℃水浴时间可提高被提取DNA数量，然而DNA纯度相应有所下降；另-20℃异丙醇沉淀DNA时间越长，后续qPCR试验抑制物就会越多。因此利用裂解液法提取DNA时，不仅需熟练其操作，亦需对每一步执行参数进行优化来提高精炼油DNA提取效率。

1.2.3 核酸共沉剂法 核酸共沉剂法对于沉淀、回收低浓度DNA尤其有效，精炼油中DNA破坏严重、总量较少，因此该方法对于回收精炼大豆油DNA具有潜在可行性。该法应用前期多采用TE溶液对油脂DNA进行水相浓缩，接着分3步走进行商业化核酸共沉剂法：即向水相中加入醋酸钠（3 mol/L，pH 5.2）（醋酸钠和水相体积比，1∶10），混匀；加入助沉剂（助沉剂和水相体积比，1∶50或1∶100），混匀；加入乙醇或异丙醇沉淀DNA。很显然TE水相体积直接决定后续醋酸钠和助沉剂用量，而助沉剂价格往往较高，因此为了节省成本，前期TE水相用量就要控制，为了保证DNA提取足量，精炼大豆油原料用量要求不低于20 mL，为解决该难题操作者往往分多次将大豆油与TE溶液混合，每次将混合物离心后移除油相，剩余水相继续与新油混合，如此重复，直至将全部大豆油原料中DNA转入TE水相。许冬倩等[22]和周红霞等[25]均用TE溶液对20 mL市售大豆油DNA进行提取，并将水相提取液与等体积CTAB裂解液混合、水浴加热，得到氯仿异戊醇（24∶1，体积比）抽提过的上清液后，二人分别采用异丙醇和核酸共沉剂法沉淀DNA，前者PCR检测35S 200 bp片段结果呈阴性，后者则成功扩增出了Lectin 118 bp、35S 195 bp、NOS 180 bp和EPSPS 320 bp 多条DNA片段，该结果说明核酸共沉剂法对于精炼大豆油DNA的提取具有较好适用性。

亦有多数研究者利用助沉剂在酸性醋酸钠和异丙醇混合液中进行DNA沉淀[20，31-32]。可选助沉剂种类众多，如酵母tRNA、糖原、其它物种DNA、不同商业助沉剂等。周红霞等[25]指出与大豆差异越大的物种，其DNA越适宜作为精炼大豆油DNA提取过程的助沉剂。助沉剂可在水油混合阶段加入，亦可添加到水油分离后的水相中。He等[20]指出在水相中加入助沉剂更利于后续PCR检测，且酵母tRNA较糖原、商业助沉剂等更适于精炼大豆油DNA的提取。

1.2.4 试剂盒法 Wizard Magnetic DNA PurificationSystem for Food Kit、Nucleospin Food Kit、DNeasy Plant Mini Kit等试剂盒均被尝试用于大豆油DNA的提取，然而不同种试剂盒对大豆油DNA提取适用性不一。Pauli等[33]用Wizard试剂盒从压榨大豆毛油中提取DNA，所得DNA量较充足，通过巢式PCR可得阳性结果，而脱胶油DNA结果呈现阴性。Costa等[18]试验发现无论是借助于Wizard DNA purification resin还是利用Wizard Magnetic DNA Purification System for Food Kit均不能从精炼大豆油中提取足量DNA用于PCR扩增。油脂精炼程度越深，DNA破坏越严重，提取难度越大，这说明Wizard试剂盒可能不适用于精炼大豆油DNA的提取。相较于Wizard试剂盒，Nucleospin Food Kit可成功从多种精炼大豆色拉油中提取DNA，Lectin基因PCR扩增均呈现阳性，其DNA提取效果甚至优于传统CTAB法[34]。Nikolic等[30]用 CTAB法和DNeasy Plant Mini Kit从大豆毛油中提取DNA，两种方法均可获取足量DNA，而试剂盒法提取的DNA纯度更高，更适于后续PCR检测，作者指出DNeasy Plant Mini Kit和Nucleospin Food Kit均是基于硅胶模吸附原理对DNA进行纯化，因此DNeasy Plant Mini Kit亦可能适用于精炼大豆油DNA的提取。

1.2.5 其它方法 程红梅等[23]自行研发的离心柱法可从10 mL精炼大豆油中提取约0.4 μg DNA。白立群等[35]首次报道了冷冻干燥法在大豆油DNA提取中的应用，作者指出大豆油DNA提取的关键步骤不是纯化，而是将油脂中DNA进行富集，该方法虽未从20 mL精炼大豆油中提出DNA，但该法DNA提取效率优于Wizard Magnetic DNA Purification System for Food Kit。

2 PCR试验

2.1 引物选取

油脂加工程度较深，PCR试验成功与否不仅与前期DNA提取过程有关，亦受后续引物选取的影响。周红霞等[25]以相同的精炼大豆油DNA为模板，扩增短链目标片段如170 bp试验失败，而当选取GC碱基对含量较高的目的片段进行扩增时，可成功检测到320 bp目的基因片段，因此对于深加工食品来说选取GC含量高、稳定性强的目的基因片段进行PCR扩增，可相对提高转基因食品检出率。

大豆卵磷脂工业加工过程为：大豆种子→破碎大豆→挤压膨化大豆，接着进行溶剂浸出，分别得到粗制大豆粉和毛油，粗制大豆粉→大豆蛋白粉，毛油→脱胶油→卵磷脂。Bogani等[24]系统的追溯了该过程中DNA的变化规律，结果发现大豆种子、破碎大豆、挤压膨化大豆和粗制大豆粉均能扩增 出 118，188，195，470，644，900 bp和1 006 bp共7条不同长度的DNA片段，而大豆蛋白粉最长只能扩增644 bp DNA片段，毛油、脱胶油和卵磷脂最长扩增片段更小，只有470 bp，这说明加工程度越深，DNA破坏越严重，对于深加工食品如精炼大豆油来说，只有选取短片段PCR扩增产物才可以提高DNA检测的准确性，多数研究者建议将待扩增片段长度限制在 200 bp 以下[19，32，36]。

2.2 PCR检测

精炼大豆油加工程度深，DNA破损严重，利用核酸蛋白分析仪对被提取DNA进行检测，A260/A280数值往往大幅偏离1.8，A260/A230数值多小于1，该结果表明被提取DNA纯度低，所含抑制物较多，后续PCR试验可能很难开展。然而Ramos等[19]试验发现 A260/A280为1.02，1.16，0.78，0.86 等的食用油DNA均顺利扩增出了174 bp rbcl和548 bp trnl基因片段，这说明被提取DNA紫外光谱检测结果与后续PCR并没有直接相关性，这也在Costa等[34]的试验中得以证实。因此，在转基因精炼大豆油的检测中，应重点依据PCR或realtime PCR结果对DNA提取方法优劣进行评判，并判定是否为转基因阳性。

DNA中残留的聚合酶抑制物可能降低PCR效率，造成假阴性误判，Nikolic等[30]指出适当稀释DNA模板可降低PCR反应抑制物浓度，促进PCR试验顺利进行。为克服食用油DNA模板数量少，纯度低等障碍，多种PCR相关技术，如巢式PCR、多重PCR、纳米PCR[20]、毛细管电泳、生物传感器[24]等技术均被报道用于精炼大豆油中转基因的检测，以提高转基因检测准确率。

3 油脂制取工艺对大豆油DNA的影响规律

完整的大豆油脂制取过程：大豆种子→清理→调质→脱皮→轧坯→挤压膨化→浸出得毛油和豆粕；毛油→脱胶→脱酸→脱色→脱臭得成品大豆油[37]。其中毛油精炼工艺涉及强碱NaOH、多次离心、洗涤、物理吸附、高于200℃高温加热等处理，这些操作均会对大豆油中DNA的完整度和残留量造成影响[38-39]。因此为提高成品大豆油中DNA的提取效率，需充分了解和研究大豆油制取工艺对大豆种子DNA的具体降解规律。

Pauli等[33]试验发现向大豆毛油中加入水相、混匀、离心即可将毛油中DNA含量降低10 000倍甚至更多，此时脱胶大豆油中DNA含量已低于检测限，再经过后续其它精炼工艺，转基因大豆精炼油与传统大豆油已具有等同性，无需转基因标识。Gryson等[40-41]亦指出脱胶是将DNA从毛油中移除的最有效步骤，且脱胶温度、时间和酸液pH等因素对DNA移除效果影响不大，然而考虑到DNA提取方法与检测结果具有直接相关性，因此作者也提出改进DNA提取方法，如增大脱胶油用量以使油脂中转基因检测具有潜在可行性。

与以上结论相反，Costa等[34]利用Nucleospin Food Kit从不同阶段的工业精炼大豆油中提取DNA，结果发现大豆种子→清理→破碎→轧坯→挤压膨化→大豆粕全程均可测得118 bp Lectin和169 bp EPSPS DNA片段，同时毛油→中和油→水洗油→脱色油→脱臭油均可测得Lectin 103 bp DNA片段，却只有毛油和脱臭油可测得106 bp EPSPS DNA片段；real-time PCR结果相仿，大豆固体样品均可检测到81 bp Lectin和83 bp EPSPS DNA扩增片段荧光信号，然而只有毛油、中和油和脱臭油可测得内外源DNA片段荧光信号，其中中和油DNA拷贝数低于检测限。以上结果说明脱胶工艺并没有完全移除大豆毛油中残留DNA，脱臭油中DNA含量不减反升，具体原因有待后续研究探讨，这为利用DNA检测技术对精炼大豆油进行转基因检测等提供了可行性理论支撑。

4 展望

目前DNA检测技术在食用油中应用最广泛的是橄榄油和大豆油[11，42]，其中橄榄油DNA检测在国外研究较多，主要用于产地溯源和掺伪检测，而大豆油DNA检测则主要应用于转基因标识，我国是转基因大豆油消费大国，尤其应注重和提高大豆油转基因检测技术。

大豆油DNA提取工作难度较大，Wizard Magnetic DNA Purification System for Food Kit、Nucleospin Food Kit和DNeasy Plant Mini Kit等试剂盒均大量被尝试用于食用油DNA的提取，当前NucleospinFood Kit已被报道成功用于工业精炼大豆油DNA的追溯，然而这些进口试剂盒价格较昂贵，并不适用于国内大批量大豆油转基因评定工作。因此国内研究者应致力于低成本、易操作、耗时短DNA提取技术的开发，考虑到不同种油脂最适DNA提取方法不同，可针对大豆油研发适用于转基因检测的平价试剂盒。

国内大豆油精炼工艺与国外略有不同，两者对脱胶和脱酸步骤的划分不一样，目前还没有关于完整大豆油制取工艺对大豆DNA降解规律的研究报道，尤其是国内的大豆油制取工艺，后续研究应弥补这块缺失，并探讨适用于监测油脂精炼过程中DNA变化的基因片段，针对该片段进行引物设计，来提高转基因大豆油检测灵敏度和准确率。