荧光偏振免疫分析技术在病原检测中的应用研究进展

张萍，周玉成，程悦宁，程世鹏，杨艳玲

（中国农业科学院特产研究所，长春 130112）

荧光偏振（FP）由于其均匀的格式、速度、准确性和自动化的高通量能力，构成了包括临床、食品和环境[1-2]等各种应用领域对小分子进行常规分析的最有效的技术之一。荧光偏振免疫分析法（Fluorescen cepolarization immunoassay，FPIA）是基于对抗体结合位点的自由分析和荧光标记抗原的竞争的一种方法，其操作简单，易于自动化，适于快速筛选。因为分析物可以与高分子量的抗体结合，所以无需分离的步骤。目前，FPIA用于确定农业产品和环境样本中农药[3-4]、抗生素[5-7]和真菌毒素[8-9]的存在，且FPIA在病原检测方面也已经得到了广泛应用。笔者综述了荧光偏振免疫技术的发展历史、原理、优缺点和在病原检测中的应用，概括了近几年国内、外针对各种病原建立的荧光偏振免疫分析方法研究进展。

1 FPIA的发展历史

在20世纪初期，Perrin最初建立了荧光偏振检测方法。1954年，免疫分析就已成为临床化学和生物化学等领域中的一个重要方法。虽然放射标记免疫分析法具有特异性强、灵敏度高和使用范围广等优点，但放射危害以及标记物不稳定等缺点也很明显。在此研究基础上，陆续发展了酶免疫法、化学发光免疫法、荧光免疫法和电化学免疫法等免疫分析方法。这些方法在实际应用中，大多数使用非均相的免疫分析技术。非均相系统灵敏度高且特异性好，但操作过程复杂繁琐，受到限制。20世纪70年代，荧光偏振第一次应用到抗原抗体反应中，并用该法研究了生物系统中抗原-抗体和激素-受体之间的作用[10-11]。1976年，荧光偏振免疫方法首次应用于筛选血清中的治疗性药物[12]。1977年，FPIA方法在检测农药苯菌灵的主要代谢物2-氨基苯并咪唑中起到重要作用，但由于受到荧光偏振测量仪发展的限制，其应用并不常见。20世纪80年代初，Jolley等[13-15]对FPIA方法进行改良，并将FPIA方法用于人体治疗药物和毒物含量测定，检测人血清中氨基糖苷类抗生素被认为是FPIA方法在医药检测应用中的开端。1988年，Colbert等[16]首次将FPIA方法应用在检测农药残留研究中，并且建立了检测血液中百草枯含量的方法。Eremin等[17]建立了在猪肉中检测磺胺二甲嘧啶残留量的方法，并用该方法对食品中药物残留进行检测。而后，美国Jolley Consulting and Research公司推出更先进的荧光偏振光分析仪，并具有易于自动化、灵敏度高且可输入多个参数等优点。Baker等[18]在2000年设计了双光路荧光偏振光分析仪，可以消除背景干扰，在测定复杂生物样品时，具有更好的灵敏度和精确度。

2 FPIA的原理

荧光偏振免疫分析与传统的酶联免疫吸附测定（ELISA）相比，最显著优势在于它是在液相中进行的一种均相分析，无需分离游离和结合的示踪物，省略了洗涤步骤。当溶液中的荧光基团暴露于平面偏振光下，产生的辐射就会被极化。在激发和发射过程中，荧光体的运动产生了反极化的结果，因此，荧光基团的运动速度越快，发射角度越偏，使用偏振器可以将荧光发射分离成水平和垂直分量。

在最简单的意义上，偏振（P）可以表达为垂直（IV）和水平（IH）平面上的发射差除以它们的总和，即P=（IV-IH）/（IV+IH）。在没有待测因素影响情况下，抗体结合示踪物，限制了其运动，偏振值较高。在待测样品存在情况下，示踪物与抗体结合少，大部分存在于溶液中，其偏振值较低。许多学者曾对这种分析原理多次进行详细的描述[19-21]。

3 FPIA方法的优缺点

3.1 FPIA的优点

无需洗涤操作，减少试剂用量；检测迅速，易于自动化，便于快速筛选；荧光标记抗原均一性好，稳定性高；不易受溶液颜色和仪器灵敏度变化等因素的影响，结果稳定。

3.2 FPIA的缺点

灵敏度比ELISA方法低；易受背景荧光、光散射以及样本基质的影响；检测范围较窄，信噪比（S/N）较低；纯化步骤复杂；需要特定的分析仪器，价格昂贵[22]。

4 FPIA研究进展

4.1 单试剂FPIA检测方法

单试剂FPIA检测方法是抗原抗体与选定的示踪物混合，进行竞争性抗原反应，将传统的FPIA方法操作步骤进行简化，孵育时间短，便于操作和运输。由于示踪物对抗体具有一定的保护作用，所以，单试剂FPIA比普通FPIA更加稳定[23]。

4.2 停流FPIA方法

当样品中病原含量较低时，竞争免疫系统达到平衡，难以区别分析信号和本地信号。停流FPIA技术测量示踪物与抗体起始反应速度，大大降低了散射光和基质荧光对检测结果的影响，且反应测量速度快，仅需要 4～6 s。

4.3 置换FPIA方法

置换FPIA技术是将示踪物与抗体提前在溶液中进行平衡，然后与样品结合，抗原将溶液中的示踪物与抗体结合物中的示踪物置换出，测定置换出的示踪物，换算样品中的抗原浓度，无需孵育便可检测，检测时间短，反应过程较为稳定，标准曲线在7 d内稳定[23]。

4.4 有机溶剂FPIA方法

在非极性有机溶剂中，表面活性剂形成的反相胶束系统可以溶解多种生物活性物质，形成透明胶状溶液。反相胶束系统的优势是可以测定非极性有机溶剂中的分析物。在分析动植物组织中的药物残留时，用可与水混溶的有机溶剂直接提取三氯乙醛[24]、2，4，5-三氯苯氧乙酸和甲基对硫磷[9]等药物；另外，FPIA反应中至少可耐受25%的甲醇或者10%乙腈，而在检测赭曲霉素A时，即使甲醇含量100%，灵敏度也不会发生很大变化[25]。

4.5 芯片FPIA方法

微芯片分析是一种很有前景的药物治疗监测方法。它是在微晶片上测定荧光偏振，并获得血清素的浓度。Tachi等[25]成功地对血清中血清素进行了定量分析，在65s内可分析出结果；微芯片FPIA方法取得的结果与克隆酶免疫分析（CEDIA）和颗粒增强浊度抑制免疫分析（PETINIA）的结果有良好的相关性。传统FPIA是用于分析各种药物的通用方法，基于微芯片的FPIA系统不仅用于植物的分析，还可用于其他药物的分析。

5 荧光偏振免疫技术在病原检测中的应用

5.1 在布鲁氏菌检测中的应用

1996年，已经出现将FPIA与其他血清学方法结合检测牛布鲁氏菌的案例。将经过平板凝集试验（BPAT）、补体结合试验（CFT）、间接酶联免疫吸附实验（IELISA）和竞争性酶联免疫吸附实验（CELISA）检测过的9 480份血清样品进行了FPIA试验。这些血清中，有561份样品是从检测出布鲁氏菌的组织和牛奶中分离出来的，8669份来自流行病学和血清学检测均为阴性的牛，250份来自免疫后不同时期的牛。当隔断值（Cut-off值）为90 mP时，FPIA的敏感性和特异性分别是99.02%、99.96%，均高于其他传统检测方法[26]。2014年，訾占超等[27]阐述了荧光偏振技术在布鲁氏菌病检测中的应用并进行了分析。

5.2 在真菌毒素检测中的应用

5.2.1 伏马菌素 伏马菌素是发现于多种商品中的霉菌毒素，包括玉米等，被认为是猪肺水肿综合症和马脑白质软化综合症的致病因子。试验证明，伏马毒素对啮齿类动物也有致癌作用。第一个报道霉菌毒素的FPIA应用是用于检测玉米中的伏马菌素[28]。科研人员对2种数据的采集和分析方法进行研究：一种是在添加示踪剂之前收集样品（IV，IH）的荧光强度，随后用于校正添加示踪剂后获得的值，通过这种方式，每个样本都确定了其背景校正，再将样品的结果与缓冲液的标准曲线对比；另一种是利用缓冲溶液的荧光强度来校正样本的背景荧光，在这种方法中，将试验数据转换成一个标准曲线，最大值为1，最小值为0，将样品的数据与缓冲液的标准曲线对比，确定伏马菌素的含量，不包括提取步骤，分析大约需要2min。玉米样品检测范围为0.5～20.0g FB1/g，平均回收率为94.3%，相对标准偏差为14.6%。第1种方法的校正背景较好，所以性能方面更有优势。

5.2.2 黄曲霉毒素 黄曲霉毒素作为致癌物，与人类和动物健康的相关性低于其他的真菌毒素，而且这些毒素在食物和饲料中的含量也较低。因此，这些毒素的检测方法需要较高的灵敏度。已有报道关于天然受污染的玉米、高粱、花生糊和花生酱中黄曲霉素敏感的FPIA，示踪剂是黄曲霉毒素荧光素偶联物，孵育时间为15min。黄曲霉素标准溶液中，黄曲霉素B1、B2、G1和G2的抑制曲线的中点分别为28、90、100和100ng/mL；该试验与高效液相色谱（HPLC）的参考方法相比较，显示出天然受污染样品的良好相关系数（r2=0.97），尽管在爆米花中存在偏差[29]。

5.2.3 玉米赤霉烯酮 玉米赤霉烯酮（ZEN）及其一些同源物质都是雌性激素，通常由产生脱氧雪腐的同种真菌产生。FPIA最初用来检测玉米赤霉烯酮和玉米相关化合物[30]，使用ZEN-荧光素示踪剂。该方法检测限为0.1g ZEN/g玉米，说明试验的效果与示踪剂孵育的时长短有关。该方法与HPLC相比较，相关系数（r2）为0.976。为建立一种敏感的FPIA来筛选玉米中玉米赤霉烯酮一类的真菌毒素，制备2种新的单克隆抗体（MAbs），与玉米烯酮类和4种荧光标记示踪剂密切相关。在灵敏度和特异性方面选择适当的追踪抗体后，建立一种能够检测出玉米烯酮类且具有相似灵敏度的FPIA。

6 结论

应用FPIA对各种病原分析的技术越来越多。据报道，FPIA的速度确实非常快，大多数需要2～15 min即可完成。重要的试验参数，如速度和灵敏度，不仅取决于抗体和示踪剂的质量，还取决于它们如何与病原相互作用。选择合适的抗体和示踪剂组合可以产生快速而敏感的抗原。像其他免疫系统一样，FPIA会受到样本矩阵的影响。除了使用最灵敏的抗体和示踪剂组合外，矩阵效应还可以通过一系列确定的程序来控制，从简单的稀释到与矩阵匹配的校准。虽然FPIA非常简单，但技术的逻辑进展可使分析步骤自动化，以进一步提高易用性，减少与操作相关的变量使用，随着FPIA技术不断进步，FPIA检测方法可能会成为各种病原检测的主要技术之一。