超临界流体色谱法在药物成分分析中的应用进展

2019-01-13郝桂明

天津药学 2019年5期

郝桂明

(天津市药品检验研究院，天津 300070)

超临界流体色谱(SFC)的诞生可以追溯到上世纪60年代，Klesper E等首次提出这个概念，此项检测技术在初期并未得到迅速应用普及，主要是因为当时的仪器设备不能精确控制检测过程中的压力，从而导致色谱分离性能的不稳定[1]。随着流体压力控制以及温度调控等技术的不断创新，SFC检测过程中的流体参数控制逐渐可以达到理想水平，因此超临界流体色谱法逐渐与药物成分分析相结合。这种检测方法相比于传统的GC和HPLC分析方法，能够充分利用超临界流体扩散速度快、黏度较小的特点，因此能够有效弥补传统检测手段的缺陷。本文以超临界流体色谱法为研究对象，不仅分析了其在手性药物与中药成分分析方面的应用，同时介绍了药物代谢产物成分分析领域中SFC的使用现状。

1 超临界流体色谱法概述

超临界流体色谱法(SFC)是一种以超临界流体为流动相，以固体吸附剂或高聚物为固定相的色谱分析方法。SFC相较于传统普遍的高效液相色谱法(HPLC)，前者能够在更短的时间内实现检测物质的有效分离，并且检测过程所需的有机溶剂更少，因此逐渐受到药物分析研究领域的重视。国外仪器设备厂家不断研制出各自的SFC检测装置，逐步实现仪器设备的商品化。我国在SFC检测装置制造方面的起步较晚，现正处于从实验室走向市场的转化阶段。陈海等[2]采用新型超临界流体色谱仪，在优化条件下于7 min内完成对4种磺胺类药物的分离并考察了色谱填料类型、共溶剂类型、共溶剂比例、背压、流速、柱室温度等条件对样品保留行为的影响。

1.1超临界流体色谱的流动相超临界流体指的是一种处于气体和液体之间的特殊流体物质，在临界状态下同时具有两者的部分优点。迄今为止，已确定的超临界状态物质可达上千种，包括一些较为常见的气体物质如CO2和N2O等，以及有机物C5H12与CCl2F2等，其中最具代表性的超临界流体是CO2。CO2实现超临界状态的实验条件是温度为31.1 ℃，压力为73.8 bar，这样的温度和压力条件在实验中较容易实现。此外CO2本身无毒，其分子结构表现为非极性，因此室温下具备很好的稳定性。CO2之所以能够作为典型的超临界流体物质，很大程度上是由于CO2能够与多种类型的LC检测器匹配，并且经济环保，可充分利用工业生产过程中排放的废气；因为该气体在标准条件下呈现为气相状态，在分离纯化CO2的过程中所需消耗的时间和能量较少。在采用SFC进行色谱分析时，为了改善CO2对极性化合物的溶解性和洗脱力，通常需要引入适量的改性剂，例如甲醇和乙醇等极性溶剂。同时，为了提升流动相的洗脱过程以及增加其选择性，通常会向碱性或酸性化合物中引入乙酸或三氟乙酸等物质，这种手段既能够有效改善待测物的峰形，又可以覆盖固定相表面的活性位点[3]。

1.2超临界流体色谱的固定相超临界流体色谱色谱柱的选择是依据待测物质的性质来决定的，使用填充柱的称为填充柱超临界流体色谱法(pSFC)，使用毛细管柱的称为毛细管超临界流体色谱法(cSFC)。几乎所有的HPLC色谱柱都适用于SFC色谱法，包括硅胶柱(SIL)、氰基柱(CN) 和一些手性色谱柱。超临界流体色谱的手性固定相是在气相和高效液相色谱固定相的基础上逐步发展起来的，也是目前应用最广泛的固定相。市场上已经实现产品化的手性固定相(CSPS)多种多样，类型数量达到1 500多种，其中最为常见的是聚糖类的大分子键合、环糊精和大环抗生素类的大环类键合以及Pirkle型的小分子键合等。李冬艳等[4]在多糖固定相Chiralpak IA、IB、IC、ID、IE和IF上成功拆分了11 种手性化合物。实验结果表明，这6种手性色谱柱对11种手性化合物具有良好的手性识别互补性，均可以在10 min之内得到良好的分离结果。改性剂甲醇、乙醇和异丙醇对手性化合物的保留时间以及手性选择性均具有良好的调节作用，需要根据不同手性物质在手性柱上的分离情况加以区别，选择使用，并调节改性剂至合适的比例。针对键合型固定相溶剂通用性的特征，特殊改性剂的应用也有助于优化手性分离。

1.3检测器高效液相色谱仪中经常采用的检测器，如紫外检测器、蒸发光散射检测器等都能在超临界流体色谱中很好应用。超临界流体色谱还可采用GC中的火焰离子化检测器(FID)、氮磷检测器(NPD)以及与质谱(MS)、核磁共振(NMR)等联用。该手段中流动相CO2不含氢元素，因此无需解决水峰抑制难题，相较于HPLC-NMR联用方法较为简便。

2 超临界流体色谱法在药物成分分析中的应用

2.1在手性药物成分分析中的应用据统计，手性药物约占临床药物数量的一半左右。这些手性药物的药效不尽相同，可以分为以下四种情况：①各对映体具有相同或者相近的药理活性；②每个对映异构体药理活性相同但作用强度却不同；③只有其中一个对映体具有预期的药理活性，而其他的却没有药效；④各对映异构体药理活性不同，而且其中一个可能是其消旋体药物不良反应的根源。手性药物进入人体后，在体内的吸收、分布、代谢和排泄中也可能表现出一定的立体选择性。因此对手性药物进行有效拆分，对药物的质量控制及药效评价具有重要的意义。

近几年来，超临界流体色谱法已经成为对手性药物的立体异构体进行拆分的有效方法。金薇等[5]采用Chiralcel OD 色谱柱(250 mm×4.6 mm，10 μm)，流动相为超临界二氧化碳-甲醇(含0.1%三氟乙酸-0.1%三乙胺)(90∶10)，背压设为15 MPa，于235 nm波长处分离依折麦布及其对映体。杨杰锋等[6]采用Chiralpak OD-H 手性色谱柱，以CO2-甲醇(89∶11)为流动相，检测波长为242 nm测定碘帕醇的对映异构体,R-碘帕醇与S-碘帕醇分离度良好。张晶等[7]研究发现多数化合物在SFC的分离效率要高于其在HPLC上的分离效率，但HPLC对轴手性化合物的分离效率要优于SFC。SFC和HPLC的分离表现出一定的互补性，随着苯环侧链烷基的碳数增加，化合物在SFC上的保留逐渐增强，而在HPLC的保留却逐渐减弱。张少敏等[8]采用ACQUITY UPC2 Trefoil CEL2 色谱柱(150 mm×3.0 mm，2.5 μm)，以超临界二氧化碳-含0.1%三氟乙酸的甲醇(78∶22)为流动相，背压为13.8 MPa，于244 nm波长处分离阿托伐他汀钙及其对映异构体。阿托伐他汀钙与其对映体在5 min内均已出峰完全，分离度达4.1。邸士伟[9]建立了奈必洛尔关键手性中间体6-氟-3，4-二氢2H-1-苯并吡喃-2-甲酸的超临界流体色谱法,采用超临界CO2-甲醇(75∶25)结合大赛璐Chiralpak IG(150 mm×4.6 mm,5 μm) 手性色谱柱直接拆分该手性中间体。谢依棋等[10]比较了高效液相色谱(HPLC)法与超临界流体色谱(SFC)法拆分肾上腺素对映体。方法均使用Chiralpak AD-H色谱柱，HPLC法以正己烷-异丙醇-甲醇-三氟乙酸-乙醇胺(88∶7∶5∶0.2∶0.1)为流动相，SFC法以CO2-甲醇(含0.2%三氟乙酸和0.1%乙醇胺)(90∶10)为流动相，检测波长均为280 nm。肾上腺素及其对映异构体在HPLC法与SFC法中的分离度为2.95和1.86，均在0.01～0.10 mg/ml范围内线性关系良好。两种方法均可应用于肾上腺素对映异构体的拆分及定量，其中SFC法更加简便、高效、绿色环保。陈香玲等[11]建立盐酸左布比卡因注射液中异构体的SFC测定方法。色谱柱为Chiralomix SD色谱柱(150 mm×4.6 mm,3.5 μm)，柱温为35 ℃，检测波长为215 nm，流动相为超临界二氧化碳-异丙醇(73∶27)。盐酸左布比卡因及其右旋异构体在0.15～1.5 μg/ml范围内线性良好，其中盐酸左布比卡因与异构体定量限均为0.15 μg/ml，检测限均为0.075 μg/ml。Oleksandr Kozlov等[12]采用超临界流体色谱法对一系列具有潜在抗癌活性和抗菌活性的手性吲哚类化合物进行了对映体分离。研究了流动相中多糖骨架、共溶剂类型和共溶剂含量对吲哚类化合物的保留率、对映选择性和对映拆分的影响。从27种受试化合物中分离出26种化合物。以直链淀粉为基础的手性固定相比纤维素为基础的手性固定相提供了更高的基线分辨率。肖梦琦等[13]采用超高效合相色谱系统对西替利嗪的左旋体和右旋体进行拆分，色谱条件使用ACQUITY UPC2 Trefoil CEL1柱(50 mm×2.1 mm,2.5 μm)，改性剂为甲醇-乙腈(5∶6)在流动相中的占比为13%、添加剂为二乙胺在改性剂中的占比为0.8%(v/v)，柱温45 ℃，背压1 600 psi，流速为0.6 ml/min。此时西替利嗪对映体的分离度为2.107，对称因子为1.328，分离效果好。

2.2在中药成分分析方面的应用近些年来，超临界流体色谱在中药成分分析领域发挥着日益重要的作用，传统的液相色谱难以准确分析成分复杂多样的中药样品，因而中药有效成分的分离提取始终是相关领域的一项研究重点，超临界流体色谱的应用在一定程度上解决了这些问题。亢静静等[14]将SFC用于蛇床子中香豆素类成分的分离，使用C18柱，改性剂为甲醇，并对改性剂的比例、CO2的流速、背压和温度等参数进行了考查，以此得出优化的色谱分离条件。Yang Huang等[15]采用超临界流体色谱-质谱联用技术成功地分离了人参提取物中17种苷类和人参皂苷，系统地研究了各种实验因素对分离功能的影响，如柱型、温度和背压、改性剂和添加剂的种类、组成溶剂的浓度等。在选定的条件下，将该方法应用于14批不同产地的人参提取物的质量评价中。吕惠生等[16]将超临界流体色谱技术应用于赤芍活性组分的分离。采用Zorbax SB-CN 色谱柱(250 mm×9.4 mm,5 μm)，考查了夹带剂、CO2流量、温度以及压力对组分分离度的影响，得到了适宜的分离条件：夹带剂含量13.64%，CO2流量20 g/min，柱温313.15 K，柱压12 MPa。此条件下可获得纯度为94.11%的芍药苷和85.65%的芍药内酯苷产物，回收率分别为95.6%和88.3%。Jie等[17]采用SFC对亲水性呋甾皂苷的分离进行了试验，研究了色谱条件对C-22位置上混合呋甾皂苷及其羟基衍生物分离的影响。对反应温度、添加剂和柱温进行了优化，采用DIOL色谱柱，流动相A为CO2，流动相B为甲醇(含0.2%氨水和3%水)，梯度洗脱，在22 min内分离出10种相似结构的呋甾皂苷。辛华夏等[18]建立了基于反相液相制备色谱和超临界流体制备色谱的组合方法，用于分离纯化醇提水沉后石油醚层中的海风藤。首先以甲醇作为改性剂,采用醇提水沉法去除海风藤甲醇提取物中的叶绿素，加入硅藻土后用石油醚回流富集目标成分。选用反相C18制备色谱柱将其分为18个组分,然后将组分在SFC模式下进行制备。选用酰胺色谱柱,以甲醇为改性剂，在柱温30 ℃、背压15.0 MPa的条件下分离得到6个高纯度化合物。ZhuoShun Dai等[19]采用超临界流体色谱在线提取五味子中木脂素，实验在15 MPa、50 ℃和4 min下进行优化，超临界CO2加入1%甲醇，洗脱体积和流速分别设定为6 ml和2 ml/min，将萃取液吹出罐外，分流率为2.5%，并建立了五味子中木脂素的提取定量方法，可在19.5 min内完成。刘芸芸等[20]建立超临界流体色谱分离纯化木香中的木香烃内酯和去氢木香内酯的方法。采用YMC-C18色谱柱(250 mm×10 mm,5 μm),流动相SC-CO2，0.13%甲醇为改性剂，背压13 MPa，柱温318 ℃，检测波长225 nm，在此色谱条件下SFC分离过程为正相色谱过程。

超临界流体色谱方法在中药成分分离方面的应用也得益于实验条件的不断提升，其中具有代表性的一项技术为超高效合相色谱(UPC2)，相关实验仪器因此可以实现更加稳定准确的检测结果。王波等[21]建立了利用超高效合相色谱法(UPC2) 快速分离和测定黄芪中5种主要黄酮类化合物(毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、美的紫檀素、芒柄花苷、芒柄花素)的方法。黄芪样品采用80%乙醇提取后，以超临界CO2-0.2%H3PO4-甲醇溶液为流动相，梯度洗脱，色谱柱为Waters ACQUITY UPC2 CSH 柱(100 mm×3.0 mm,1.8 μm)，检测波长为280 nm。5种黄酮类成分的检出限及定量限范围分别在0.3～0.5 mg/kg和1.0～2.0 mg/kg之间，加标平均回收率均高于99.7%，相对标准偏差(RSD)小于2.2%(n=6)。袁云等[22]为了分离瓜蒌子，创新性地结合了离线二维反相液相色谱方法与超临界流体色谱方法，其中前者被应用于实验的第一维，即按色谱峰采集样品中制备的12个组分，后者被应用于实验的第二维，即将第一维得到的组分再次分离。SFC方法采用了乙醇-正己烷(3∶7)的混合溶剂作为改性剂，既提供了适当的洗脱能力，也保证了在上样量增加时满足样品溶解的要求。

2.3在药物代谢产物分析中的应用在进行药物代谢产物研究时，研究人员通常会采用HPLC或HPLC-MS技术。近些年来SFC技术不断完善，其应用于代谢产物成分分析也逐渐被报道。朱健等[23]在探究大鼠小肠各肠段对异甜菊醇钠的吸收情况时引入了UPC2方法，试验采用ACQUITY UPC2 TM BEH(100 mm×3.0 mm，1.7 μm)色谱柱，流动相A为二氧化碳，流动相B为1.5%甲酸甲醇溶液进行梯度洗脱，实验时间为7 min，大大缩短了检测周期，并且可以同时获得较高的专属性和灵敏度。Mariosimone等[24]首次建立了基于超临界流体萃取与超临界流体色谱-质谱联用(SFE-SFC-QQQ/MS)的在线检测方法，用于全血中类胡萝卜素的检测。利用现有的标准，结合离子扫描和多反应检测进行定性，并采用改进的方法对β-隐黄质、玉米黄素、β-胡萝卜素和辣椒红素进行定量分析。Solfrid等[25]用UHPSFC-MS/MS建立了血清中R/S-西酞普兰对映体分离和定量的方法。试验采用UPC2 Trefoil CEL2色谱柱，流动相为二氧化碳-10 mM醋酸铵的甲醇溶液(70∶30)，进样量为1 μl，运行时间为4 min，线性范围为5～500 nM，RSD为3.4%～4.5%，回收率为81%～91%。S J Kumari A等[26]建立了一种简单、快速、环保的超临界流体色谱-串联质谱方法，可同时测定生物样品中5个AA代谢物(PGD2、PGE2、PGF2α、6KetoPGF1α和 LTB4)。线性范围为0.5～100 ng/ml(R2≥0.995)，PGD2、PGE2、 PGF2α和LTB4的定量限均为0.5 ng/ml，6KetoPGF1α的定量限为2.5 ng/ml。方法的日内和日间精密度均小于15%，准确度在83%～109%。WeiPing Wang等[27]建立了一种简单、灵敏、高效的超临界流体色谱串联质谱法测定比格犬血浆中尼莫地平的方法。用丙酮沉淀蛋白质，从血浆中提取分析物，以尼群地平为内标物。采用Acquity UPC2TMBEH2-EP色谱柱，以1.5 ml/min的流速梯度洗脱。应用多重反应监测尼莫地平的m/z419.3→301.3和尼群地平的m/z361.4→315.2的转变进行定量。