瓯柑籽油中柠檬苦素类化合物的脱除工艺研究

曹雪丹 方修贵 王天玉 赵 凯

（浙江省柑橘研究所 台州318026）

瓯 柑(Citrus suavisima Hort.ex Tanaka)是芸香科柑橘属的一个栽培变种[1]，因其主要分布在我省浙南瓯江沿岸而得名，在民国前史料《浪迹叙谈》中既有“永嘉之柑，俗谓之瓯柑……”的记述[2]。瓯柑虽然存在皮厚而粗、蒂高多籽、可食率低等缺点，但是其果汁、果皮中都含有黄酮等具有抗氧化能力的生物活性成分，一般认为瓯柑果实中主要的苦味成分是新橙皮苷和柚皮苷[3]。除此之外，瓯柑籽中也含有大量活性物质如柠檬苦素类化合物等。但是目前国内相关研究主要关注于瓯柑果肉、果汁和果皮的黄酮类化合物分离、鉴定及其生物活性评价方面[4,5]，针对瓯柑籽的研究较少，仅高文霞等[6]从瓯柑籽中成功分离出柠檬苦素（C26H30O8），杨小凤等[7]检测出瓯柑籽中含有的微量元素明显高于果肉、果汁，如Ca约为3倍，Fe约为8倍，Mg约为2.4倍，Mn约为1.8倍，Zn约为5.3倍。说明瓯柑籽作为瓯柑果肉、果汁加工产业的废弃物仍具有重要的综合利用价值，亟待开发。

柑橘籽中通常含有丰富的油脂（38.86%～42.59%）[8]，它们不同于用柑橘皮所制取的精油，其主要成分是脂肪酸，包括油酸、亚油酸及亚麻酸等大量不饱和脂肪酸，可考虑供人食用。但是，在制取瓯柑籽油的过程中，具有抗癌、镇痛抗炎和抗病毒等广泛生物活性的柠檬苦素类化合物[9]也被保留了下来。这些物质虽然具有一定的功能性，但其苦味阈值较低（1.0mg/L），且苦味是柚皮苷的20倍[10]，对瓯柑籽油的口感影响极大，从而在一定程度上限制了瓯柑籽油的推广和开发。本试验采用乙醇加热法从瓯柑籽油中脱除柠檬苦素类化合物，以期为瓯柑籽、油的加工和瓯柑籽中柠檬苦素类化合物的利用提供理论依据和指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

瓯柑籽，产自浙江省温州市，由浙江森马生态农业发展有限公司提供；柠檬苦素（≥98%），诺米林（≥98%），美国斯坦福（Stanford）分析化学公司；乙腈（色谱纯），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙醇等均为市售分析纯。

1.1.2 仪器与设备

1200 型高效液相色谱仪（安捷伦，美国）；NN-K566WS型微波炉（松下电器产业株式会社，日本）；CZR108型榨油机（广州万彪通用设备有限公司）；JK-OB-5G型油浴锅（上海精学科学仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 瓯柑籽油的制备及柠檬苦素类化合物的脱除方法

将瓯柑籽经分拣筛选去除异物和空籽后置于微波炉中高火加热2min，趁热投入螺旋式榨油机中进行压榨。收集瓯柑籽油并在20±1℃下静置过夜，取上清液于4℃冷藏，备用。

将一定量的柑橘籽油和乙醇溶液缓慢移入具塞试管中，在恒温水浴锅内预热至目标温度后立即振荡数次进行萃取脱苦，待萃取结束即用冷水降至常温，静置分层后量取萃取液并用高效液相色谱检测柠檬苦素和诺米林含量。其中柠檬苦素类化合物的脱除量计算公式如下：

脱除量（µg/ml）=（C×V）/Vm。C：萃取液中柠檬苦素类化合物的浓度，以µg/ml计；V：萃取液的体积，以ml计；Vm：柑橘籽油样品体积，以ml计。

1.2.2 单因素脱除试验

分别考察了不同料液比（1:1、1:3、1:5、1:7、1:9）、不同乙醇浓度（10%、30%、50%、70%、90%）和不同温度（30、40、50、60、70℃）对柑橘籽油中柠檬苦素类化合物脱除量的影响。

1.2.3 正交优化试验

根据单因素试验结果并结合生产实践，以料液比（A）、乙醇浓度（B）和温度（C）为主要影响因素，设计L（934）正交优化试验，各因素和水平见表1。

1.2.4 柠檬苦素及诺米林含量的测定

1.2.4.1液相色谱条件：色谱柱：Agilent C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈/水(40/60)；流速：1.000mL/min；进样量：10μL；柱温：30℃；检测波长：210nm；以保留时间定性，外标法峰面积定量。

1.2.4.2标准溶液的配制和线性相关性测定

标准储备溶液：准确称取柠檬苦素和诺米林标准品各0.0020g（精确到0.0001g），分别用乙腈配制成质量浓度为200µg/ml的标准溶液，于4℃下储存，备用。

吸取适量的标准储备液，分别用乙腈逐步稀释成质量浓度为0.1，1，2，5，10，50µg/ml的一系列标准工作溶液，在1.2.4.1的条件下，分别进样10μL，平行测定3次，以标准品质量浓度x(µg/ml)为横坐标，峰面积y(mAU·s)为纵坐标作线性回归，绘制标准曲线。

表1 正交试验因素水平表

2 结果与分析

2.1 柠檬苦素和诺米林的高效液相检测及标准曲线绘制

如图1和2所示，柠檬苦素和诺米林在0～50µg/ml 的浓度下与峰面积之间具有较好的线性相关性，线性方程分别为y 7.235x+0.256和y=7.189x-0.424。

2.2 单因素试验

2.2.1 料液比对柠檬苦素及诺米林脱除量的影响

乙醇浓度90%，温度70℃下考察不同料液比（1:1、1:3、1:5、1:7和1:9）对柠檬苦素及诺米林脱除量的影响见图3。

由图3可知，柠檬苦素和诺米林从瓯柑籽油中的脱除量随料液比的增大呈先升后降的趋势，且在料液比为1:5时脱除量最高。

2.2.2 乙醇浓度对柠檬苦素及诺米林脱除量的影响

料液比1:5，温度70℃下，不同乙醇浓度（10%、30%、50%、70%和90%）对柠檬苦素及诺米林脱除量的影响见图4。

图1 标品和样品中柠檬苦素及诺米林的高效液相色谱

图2 柠檬苦素及诺米林的标准曲线

图3 料液比对柠檬苦素及诺米林脱除比例的影响

图5 温度对柠檬苦素及诺米林脱除量的影响

由图4可知，柠檬苦素和诺米林从瓯柑籽油中的脱除量随乙醇浓度的增大呈先升后降的趋势，且在乙醇浓度为70%时柠檬苦素的脱除量最高，而乙醇浓度为50%时诺米林的脱除量最高。同时，较低浓度的乙醇溶液对柠檬苦素的脱除作用有限，其脱除量明显低于诺米林，这可能是柠檬苦素在不同浓度的乙醇溶液中溶解度差异较大所致。

2.2.3 温度对柠檬苦素及诺米林脱除量的影响

料液比1:5、乙醇浓度50%时，不同温度（30、40、50、60、70℃）对柠檬苦素及诺米林脱除量的影响见图5。

由图5可知，柠檬苦素和诺米林从瓯柑籽油中的脱除量随温度的升高呈先缓慢增大后降低的趋势，且在60℃时脱除量最高，随后明显下降。这可能是由柠檬苦素类化合物的热稳定特性造成，当温度达到一定的范围后柠檬苦素和诺米林是否发生一定程度的降解尚待进一步研究。

表2 正交试验结果与直观分析

2.3 正交优化试验

基于单因素试验结果并结合生产实践，选取料液比（A）、乙醇浓度（B）和温度（C）进行正交试验，结果见表2。

由表2可知，采用乙醇加热法脱除瓯柑籽油中的柠檬苦素和诺米林的最佳组合为A3B2C2，即料液比1:7，乙醇浓度70%，温度60℃为柠檬苦素类化合物最佳脱除条件，通过验证试验得出此条件下柠檬苦素从瓯柑籽油中的脱除量为1101.01μg/ml，诺米林为600.06μg/ml。

3 结论

本试验采用乙醇溶液加热脱除瓯柑籽油中的柠檬苦素类化合物，在料液比1:7，乙醇浓度70%，温度为60℃的脱除条件下，柠檬苦素从瓯柑籽油中的脱除量为1101.01μg/ml，诺米林为600.06μg/ml，经过脱除工艺处理的瓯柑籽油色泽更加透亮，苦味也得到明显的改善，且脱除得到的含有柠檬苦素类化合物的乙醇溶液还可以通过进一步浓缩、纯化加以收集和利用。