桑葚花青素提取纯化研究进展

栾琳琳，卢红梅＊，陈莉

（1.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵阳 550025；2.贵州大学 贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵阳 550025）

桑葚（Mulberry）是桑科、桑属（Morus alba L.）多年生木本植物桑树的果实，又称桑椹、桑枣、桑果等，含有丰富的营养物质，被国家卫生部列为首批药食同源植物，被誉为“21世纪最佳保健果品”［1］。桑葚中的花青素是其主要的生物活性成分，具有抗氧化、抗癌、降血糖、预防心血管疾病、减少脂肪生成等多种生理活性功能［2－9］。

花青素（Anthocyanidins）又称花色素，是一种天然的植物色素，多以糖苷的形式存在，形成花色苷（Anthocyanins）［10］。目前已确定的花青素有20 多种，在植物中常见的有6种：天竺葵色素（Pg）、芍药色素（Pn）、矢车菊色素（Cy）、锦葵色素（Mv）、牵牛花色素（Pt）和飞燕草色素（Dp）［11］。桑葚中花青素种类丰富，主要成分是矢车菊-3-葡萄糖苷和矢车菊-3-芸香苷［12，13］。目前，对桑葚花青素的提取、纯化已成为国内外的研究热点，因此，本文综述了桑葚花青素提取、纯化的方法，为桑葚花青素的进一步研究和应用提供了参考。

1 桑葚花青素的提取

提取是分离、鉴定和利用花青素的重要步骤，由于花青素特殊的结构和化学成分赋予了花青素多种生物活性，这些活性物质在提取过程中极为不稳定，所以对花青素的提取提出了较高的技术要求。有关桑葚花青素的研究报道很多，一些提取方法如溶剂提取、超声辅助提取、微波辅助提取、酶提取和超临界流体萃取等都得到了应用。

1.1 溶剂提取法

溶剂提取是桑葚花青素的传统提取方法。溶剂多选择水、乙醇、甲醇、丙酮或混合溶剂。为提高花青素的提取效率，常在提取溶剂中加一定浓度的盐酸、三氟乙酸或柠檬酸等酸。Suhl H J等［14］以70%乙醇为提取剂，以料液比1∶20（g／mL）冷藏过夜提取桑葚花色苷，得 出 桑 葚 花 色 苷 含 量 为 170.5mg／100g。Pawlowska A M 等［15］采用2%HCl甲醇提取桑葚花色苷，料液比为1∶6（g／mL），得到花色苷含量为27mg／100g。

国内对桑葚花青素的溶剂提取研究主要集中在提取工艺参数优化上，提取剂多为盐酸-乙醇。例如Qin C G等［16］用95%乙醇／0.1%HCl（比例1∶1）在室温暗处提取4h，得到浓度为128μg／mL的桑葚花青素。江岩［17］采用溶剂浸提法从新疆药桑椹中提取花青素，最佳提取工艺为溶剂体积比（0.1%HCl溶液∶95%乙醇）40∶60、固液比1∶20（g／mL）、提取温度50℃、提取时间90min，得到桑椹花青素得率为0.0305%。李娜［18］选取酸化乙醇作溶剂提取桑葚花色苷，最佳工艺参数为乙醇水溶液（90∶10，V／V）、盐酸浓度0.5%、提取时间30min、料液比1∶20（g／mL）、提取温度50℃，该条件下花色苷得率为0.269%。蔡荣荣等［19］以浙江省内栽培种植的十大品种为研究对象，利用正交试验筛选出提取桑葚花青素的最佳工艺：乙醇浓度50%、提取液pH 4、料液比1∶1（g／mL）、浸泡3次，从不同品种桑葚果汁和果渣中提取的花青素得率在0.04%～0.39%，其中从十大品种的果渣中提取的花青素的得率最高（0.39%）。程秀玮等［20］在单因素试验的基础上，采用响应面分析法对桑葚花色苷的提取工艺进行了优化，最佳工艺条件为：料液比1∶25，提取时间135min，提取温度62℃，在此条件下，花色苷提取率最高，达到5.09mg／g。朱建斌等［21］运用响应面分析法对桑葚花青素的提取参数进行了优化，最佳工艺参数为料液比1∶39（g／mL），提取温度51℃，提取时间39min。在此工艺参数下桑椹花青素质量分数为24.93mg／g。Wu X等［22］应用双水相萃取来提取桑葚花青素，得出由30%乙醇、20%硫酸铵组成双水相系统，在pH 4.5、温度（35±1）℃条件下，可分离出大部分花青素，去除大约90%的游离糖。

综合以上实验研究可得：提取剂的使用量以1∶10～1∶40（g／mL）料液比为宜；在提取温度的选择上，国外通常将温度控制在低温或常温下，而国内的提取温度在30～70℃之间，花青素属于热敏活性物质，温度过高易造成花青素降解，提取时间在1～2h为宜。

溶剂提取法虽然操作简单，对设备要求不高，但提取时间长，提取效率低，因此尽量选择现代化仪器或提取方法来提高提取效率。

1.2 超声辅助提取法

超声波提取法主要是利用超声波的机械振动及空化作用达到提高花青素提取率的目的。超声波提取技术是一种物理方法，在提取过程中不易破坏花青素的结构，不易造成花青素的损失。

Espada-bellido E等［23］对桑葚花青素的提取进行了优化，最佳提取条件为pH 3的76%甲醇水溶液，提取温度48℃，超声振幅为70%，循环0.7s，料液比1.5∶11，得到花青素提取率为4.02%。马义虔等［24］运用超声波辅助提取桑葚花青素。在单因素试验基础上，采用Box-Benhnken设计研究超声时间、超声温度和乙醇体积分数对桑椹花青素提取率的影响。结果表明：最佳提取工艺条件为乙醇体积分数60%，以柠檬酸调pH为2.0，料液比1∶10，超声时间35min，超声温度53℃，加装冷凝回流管提取2次，得到桑椹花青素含量约为259.50mg／100g。牛天羽等［25］选取4种桑葚（黑果桑、白果桑、野生蒙桑和栽培蒙桑）超声辅助提取花色苷，最佳提取条件为：提取液为体积分数60%的酸化甲醇，超声温度41℃，超声时间39min，料液比1∶53（g／mL），4种桑葚中栽培蒙桑花色苷含量最高，为11.815mg／g。程秀玮等［26］在溶剂提取的基础上采用超声辅助提取桑葚花色苷，结果表明：最佳提取工艺条件为超声时间20min，超声温度50℃，超声功率430W，在此条件下，花色苷含量最高，达到5.7681mg／g，较溶剂提取法测得的花色苷含量显著提高。Zou T B等［27］运用64%甲醇（含1%三氟乙酸）提取桑葚花青素，提取温度43℃，料液比1∶24，提取时间40min，花青素含量为（64.70±0.45）mg／g。李红姣等［28］运用超声波辅助乙醇的方法提取桑椹花青素，最佳工艺条件为料液质量浓度0.07g／mL，提取剂乙醇体积分数60%，提取液pH 5，提取时间0.5h，超声波功率180W。在优化的工艺条件下，桑椹花青素的提取得率为69.01mg／g。徐建国［29］以陕西安康的桑椹果渣为原料，研究超声波提取桑椹红色素的最佳工艺，得出最佳工艺参数为含0.01%HCl的60%乙醇溶液为提取剂，提取功率200W，超声时间10min，料液比1∶15，提取1次，色素提取率为97.76%。

超声辅助提取法具有提取时间短、提取效率高、适用范围广、设备简单易操作等特点，将超声辅助提取法应用于桑葚花青素的提取过程中，可提高桑葚花青素的得率，也可适用于工业化生产。

1.3 微波辅助提取法

微波频率较高，会导致植物细胞内温度迅速上升，利用细胞内外的不同渗透压使细胞壁破裂或结构疏散，胞外溶剂渗入到细胞内，溶解并且释放细胞内花青素。微波热效率较高，温度迅速升高，使用微波辅助提取可缩短提取时间，明显提高花青素的提取效率。目前微波辅助技术在黄酮类、多酚类物质等有效成分的提取已广泛应用。

张朝红等［30］利用响应面法对微波辅助提取果桑花色苷的工艺进行了优化，结果表明：料液比1∶20（g／mL）、乙醇体积分数70%、pH 1、微波功率540W和提取时间100s为最佳工艺参数，果桑花色苷的提取率为2.89mg／g。Zou T等［31］运用微波辅助提取法提取桑葚花青素，结合响应面分析法，得出桑葚花青素最佳提取条件为：59.6%酸化甲醇，微波功率425W，料液比1∶23，提取时间132s，得出桑葚花青素含量为54.72mg／g。罗政［32］分别采用溶剂提取法和微波辅助提取法提取桑葚花色苷，通过单因素试验，得出了微波辅助提取法桑葚花色苷的提取率相较溶剂提取法要提高15%～20%。通过响应面试验得出，微波提取的最佳工艺参数为料液比1∶16，时间50s，功率626W，乙醇浓度70%，得到粗提物中花色苷含量为3.54mg／g。张国栋等［33］研究了微波辅助提取桑葚红色素的最佳工艺，发现在40%的乙醇-1%盐酸，1∶20的料液比，微波功率800W处理10min时其512nm的处吸光值达0.662，提取效率最佳。同参数下与不进行微波提取的对照相比较，微波提取的提取率显著高于对照。

微波辅助提取法对植物细胞壁的破裂能力强，提取效率高，提取时间短，适用范围广，但微波辅助法在提取过程中易造成局部过热而导致桑葚花青素降解，且对实验容器要求高，一般容器不能满足微波要求，而且微波辅助法提取目前仅限于少量提取实验，还不具备工业化大生产。

1.4 酶法提取法

酶提取法一般是建立在溶剂提取法的基础上，根据植物细胞壁的构成选择相应酶将植物细胞壁组分成分分解或者降解，暴露出细胞内的有效成分，溶解于溶剂中，从而提取细胞内的有效成分，此类方法称为酶提取法。

胡彦新等［34］利用响应面试验优化果胶酶提取桑葚酒渣中花色苷的工艺条件，得出加酶量0.2%、提取温度64℃、提取时间145min。在此试验条件下花色苷的提取率为4.68mg／g。霍琳琳［35］通过比较纤维素酶和果胶酶的添加对色素提取的影响得知，添加纤维素酶对色素提取的影响不大，而少量添加果胶酶能显著提高色素得率，即果胶酶浓度0.2%，在温度50℃下提取2h，色素得率为0.499mg／g。

1.5 其他提取法

1.5.1 联合辅助提取

基于单一提取方法的局限，许多学者开始采用多种联合辅助提取方法提取桑葚花色素，弥补单一提取方法的缺陷，提高花青素的提取率。

胡金奎［36］采用水浴振荡提取、超声辅助提取和超声-微波辅助提取桑葚中的花色苷，并分别优化了这3种方法的提取工艺条件，在各自最优提取条件下，比较发现超声-微波辅助提取方法优于超声辅助提取，超声辅助提取优于水浴振荡提取，最优条件为：微波功率90W，料液比3，提取时间180s。

1.5.2 超临界CO2法

超临界二氧化碳萃取分离过程的原理是利用超临界二氧化碳对花青素具有特殊的溶解作用，利用超临界二氧化碳的溶解能力与其密度的关系，即利用压力和温度对超临界二氧化碳溶解能力的影响而进行的。超临界流体二氧化碳萃取过程是由萃取和分离组合而成的。

罗政通过响应面试验，优化超临界CO2提取桑葚花色苷的工艺参数，得出提取压力31MPa，时间80min，提取温度40℃，花色苷提取率为83.10%。

超临界CO2法比传统溶剂提取法拥有更高的溶解性和渗透力，由于其能避免提取物的热降解，因此，比溶剂提取法的提取率和纯度更高。但目前国产的超临界萃取设备容积小，进口设备价格昂贵，因此，无法满足工业化生产的需要。

2 桑葚花青素的纯化

桑葚花青素的提取液中含有淀粉、蛋白质、糖类等杂质，影响花青素的纯度和稳定性，也不利于花青素的鉴定和利用，所以需要对花青素提取液进行纯化。目前，花青素的纯化方法有纸层析法、薄层析法、柱层析法（包括大孔树脂法和离子交换树脂法）、膜分离法、高效液相色谱法和联合技术法等。已报道的桑葚花青素的纯化方法有大孔树脂法、高速逆流色谱法、联合技术法。

2.1 大孔树脂法

大孔吸附树脂是利用树脂的吸附性和筛选性能相结合的原理对目标成分进行分离的方法。该方法具有操作简单、生产成本低、可重复利用等特点。近几年，许多学者用大孔树脂对桑葚花青素的分离得到了广泛的应用。

徐颖［37］利用 Amberlite XAD-7HP型大孔树脂对桑葚花色苷进行纯化，经过纯化，花色苷含量从3.14%上升到35.32%，从而分离出纯度较高的花色苷纯化物。Yao C等［38］对5种大孔树脂（XAD-7HP、AB-8、HP20，D101和X-5的吸附／解吸性能进行评估，结果显示：XAD-7HP显示出比其他树脂更高的吸附／解吸能力和比率，吸附率容量为3.57mg／g，吸附率和解吸率分别为86.45%和80.81%，纯度达93.6%。李瑞琦［39］使用D101型大孔树脂对提取后的桑葚红色素进行纯化，对纯化前后的桑葚红色素的色价进行测定，结果分别为38.6和91.4，说明D101型大孔树脂对桑葚红色素的纯化效果很好。张增沛等［40］采用AB-8大孔树脂分离、纯化药桑葚花青素，得出最佳工艺参数为：样液质量浓度为0.3g／mL，pH 为2.54，吸附流速0.5mL／min；洗脱剂乙醇体积分数为 45%，pH 为0.5，洗脱流速为2mL／min。吴庆智［41］综合比较了AB-8、HPD-400A、HPD100 3种树脂对桑葚色素的吸附、解吸性能，结果显示：AB-8树脂吸附性能好，解吸量最大。唐榕等［42］从 大 孔树脂 HPD600、D101、LX1180、AB-8、DA201-C中筛选出性能较优的树脂对桑葚花色苷进行纯化，结果表明：HPD600是纯化花色苷较为理想的树脂，除糖率为67.6%，纯化后的样品总花色苷含量为16.7%，色价为46.1。赵丽萍等［43］比较了AB-8、NKA 2种大孔树脂分离、纯化药桑椹花青素的效果，经AB-8大孔树脂纯化后，药桑椹花青素总黄酮含量及总抗氧化能力分别提高了8.507mg／g和55.207U／mg，分别是NKA大孔树脂纯化后提高值的3.3倍和14.1倍，与NKA大孔树脂法相比，AB-8大孔树脂对药桑椹花青素的分离、纯化效果更好。Liu X等［44］用大孔树脂法分离、纯化桑葚花青素，发现纯化后桑葚总花色苷含量由147.68mg／L上升至2725.46mg／L，在选取的6种树脂（D3520、D4020、X-5、NKA-9、AB-8、D101A）中，X-5显示出对桑葚花青素最佳的吸附能力。胡金奎等［45］分别对12种大孔吸附树脂对桑葚花色苷的吸附性能进行了比较，通过静态吸附和解吸实验筛选出最佳大孔吸附树脂为LX-68。用LX-68树脂纯化后色素的色价为114，纯度为39.9%，花色苷收率为91.5%。

综上可知，大孔树脂法可分离出纯度较高的桑葚花色苷纯化物，各种各样的树脂填料也能不同程度地提高花青素的色价和纯度，其中，国内应用较多的树脂是AB-8型大孔树脂，用得较好的是XAD-7HP型大孔树脂，花青素纯度可达93.6%。不同大孔树脂对桑葚花青素纯化的效果差别很大，可能是受到大孔树脂的孔径、比表面、极性等因素的影响。

2.2 高速逆流色谱法

高速逆流色谱法是一种液-液分配色谱技术，不用固体支撑体来保留固定相，避免样品的不可逆吸附、失活和变性等问题，近年来逐步发展成为一种备受关注的新型色谱分离技术。

杨玲等［46］采用高速逆流色谱分离制备药桑葚花色苷。以甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水-三氟乙酸（2∶2∶1∶5∶0.01，V／V）为 溶 剂 体 系，进 样 量50mg，分离得到纯度分别为99.24%、88.5%、99.9%和96%的4个花色苷单体。徐渊金［47］采用高速逆流色谱对桑葚花色苷进行分离、纯化，溶剂系统为水-正丁醇-TBME-乙腈-TFA（5∶3∶1∶1∶0.001，V／V）和水-正丁醇-TBME-乙腈-TFA（5∶4∶1∶1∶0.001，V／V），分离得到花色苷单体Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ。Soojung C等［48］使用高效逆流色谱法分离桑葚花青素，双相溶剂体系组成为叔丁基甲基醚-正丁醇-乙腈-0.01%三氟乙酸（1∶3∶1∶5，V／V），结果显示：高效液相色谱法即使在较大的样品量下也能快速有效地分离矢 车 菊-3-葡 萄 糖 苷 和 矢 车 菊-3-芸 香 苷 （200～1000mg）。

目前，利用高速逆流色谱法分离纯化桑葚花青素的研究颇少，由于高速逆流色谱法不仅可以获得高纯度的分离组分，同时具有操作成本低、制备量大等特点，能用于工业化生产，具有广阔的发展研究前景。

2.3 联合纯化方法

为了寻找更好的纯化方法，联合纯化技术对桑葚花青素的纯化研究相继得到报道。如Mariana N S等［49］采用C18Acclaim?120色谱柱结合甲醇-三氟乙酸-水为流动相在黑桑葚提取物中分离出3种花青素，经鉴定为矢车菊素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-芸香苷和天竺葵素-3-葡萄糖苷。通过MS分析确定，桑椹提取物中含量最丰富的花青素是矢车菊素-3-葡萄糖苷（64.13%）和矢车菊素-3-芸香糖苷（35.21%）。Zhang W N等［50］从2种桑葚渣中鉴定出5种花青素，其中矢车菊素-3-葡萄糖苷和矢车菊素-3-芸香苷是主要的花青素成分，经Sephadex LH-20分离及AB-8大孔树脂纯化后纯度均在98%以上，2种花青素的完全回收率为57.4%。Chen Y等［51］采用柱层析和高速逆流色谱法相结合的方法，从桑葚中分离出高纯度的花青素单体。用Amberlite XAD-7HP柱和80%乙醇（0.1%HCl）纯化后，得到一部分纯度为68.6%的花青素混合物。使用正丁醇-甲基叔丁基醚-乙腈-水-三氟乙酸（30∶10∶10∶50∶0.05，V／V）的双相溶剂系统的高速逆流色谱法分离花青素单体。获得3种单独的飞燕草素-3-O-芸香糖苷、矢车菊素-3-O-芸香糖苷和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷。

除此之外，花青素的分离纯化方法还有膜分离法、凝胶层析法等。膜分离法是在分子水平上不同粒径分子的混合物在通过半透膜时，实现选择性分离纯化的技术。采用膜分离法纯化桑葚花青素的报道还未见报道，陈文良等［52］研究膜分离技术分离、纯化葡萄籽中低聚原花青素的工艺过程。采用微滤、超滤的膜分离过程，对葡萄籽中低聚原花青素进行分离和提纯。相比于传统的以热浓缩为主的工艺方法，工艺过程引入膜分离的高新技术，工艺简单、高效，耗能少，产品的质量指标接近国外高端产品，适用于产业化的规模应用。

凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。王二雷［53］将蓝莓花青素粗提物经过Sephadex LH-20凝胶层析后，发现25%的酸化乙醇能将粗提物分离成3段稳定的花青素组分，且每段组分中花青素纯度分别达到59.53%、68.04%和65.79%。此法在花青素纯化方面的应用不多，该技术尚不成熟，与其他方法的联合使用将会是新的发展趋势。

3 展望

桑葚花青素作为一种天然水溶性食品色素，具有很好的保健功效和药用价值。花青素的应用前景广阔，但仍有很多问题需要进一步解决。

研究层面上：虽然在桑葚花青素提取、纯化的研究方面已有很大进展，但目前提取分离的桑葚花青素提取率低，产量不高，研究开发出高效、高纯度的提取纯化技术是近一段时间的研究热点；目前，国内外对桑葚花青素的提取普遍使用酸化的甲醇和乙醇溶剂，考虑到食品中残留甲醇的毒性及安全、适口的要求，使用食品级提取剂将会是合理的提取溶剂。

产业层面上：目前，桑葚花青素的产业化开发少，难以形成规模；桑葚的开发利用多为果汁、果酒、果醋等，桑葚花青素的药用价值较少得到合理的开发利用。

总而言之，桑葚花青素的开发利用将是近几年的研究热点，与人体健康、食品安全和工业生产等领域均有联系。我国开展了桑葚花青素的研究和利用，与世界顶尖水平相差不远，市场对桑葚花青素产品有大量需求，科研工作者应抓住机遇，深入研究，为推动研究工作而努力。