七氟醚与丙泊酚麻醉患者含药血清对人胶质瘤细胞生物学行为的影响及其机制

姜虹宇，徐远志，赵耀东，楼美清，时飞

(1无锡市第三人民医院，江苏无锡214000；2 上海交通大学附属第一人民医院)

多形性胶质母细胞瘤是成人最常见和最致命的原发性恶性脑肿瘤，患者预后很差[1]，手术联合放化疗仅能延长患者2～4个月的生存期[2]。七氟醚是临床常用的吸入麻醉诱导药物。有研究发现，七氟醚在体外可抑制肺癌细胞增殖和迁移[3]。丙泊酚是临床广泛使用的静脉麻醉药物，其对机体免疫力的影响以及与肿瘤复发的关系已引起关注。但不同麻醉药物对肿瘤生长、侵袭和转移的影响可能不同[4]。2016年6月～2018年6月，本研究比较了七氟醚与丙泊酚麻醉患者含药血清在体外对人胶质瘤细胞生物学行为的影响，并探讨其可能的作用机制。现分析结果并报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人胶质瘤细胞系SHG-44(以下称SHG-44细胞)，购自上海复祥生物科技有限公司。Multiskan GO全波长酶标仪，美国Thermo Fisher Scientific公司；FACSCanto Ⅱ流式细胞仪，美国BD公司；Transwell系统，美国康宁公司。CCK-8试剂盒，日本Dojindo公司；Annexin V Apoptosis Detection Kit、Cycletest Plus DNA Reagent Kit，美国BD Bioscience公司。

1.2 含药血清制备 选择2016年6月～2018年6月无锡市第三人民医院收治的胶质瘤患者30例。所有患者符合《中国中枢神经系统胶质瘤诊断与治疗指南(2015)》，WHO分级Ⅰ、Ⅱ级。排除术前接受放化疗者、术前1个月出现急慢性感染或免疫系统疾病者。随机将患者分为对照1组、七氟醚1组、丙泊酚1组，每组10例。其中，对照1组男6例、女4例，年龄(50±8)岁，体质量(60±8)kg，ASA分级Ⅰ级4例、Ⅱ级6例；七氟醚1组男7例、女3例，年龄(53±10)岁，体质量(53±12)kg，ASA分级Ⅰ级4例、Ⅱ级6例；丙泊酚1组男8例、女2例，年龄(44±5)岁，体质量(56±10)kg，ASA分级Ⅰ级5例、Ⅱ级5例。三组性别、年龄、体质量、ASA分级具有可比性。所有患者术前禁食、禁水10 h，入室后常规开放静脉通道，监测动脉血压、心率、脑电双频指数等。七氟醚1组气管插管后连接呼吸机机械通气，采用丙泊酚2 mg/kg、咪达唑仑0.1 mg/kg麻醉诱导，七氟醚维持麻醉，呼气末浓度维持1.5～2.0 MAC。丙泊酚1组气管插管后连接呼吸机机械通气，丙泊酚TCI模式输注1.5 μg/mL、咪达唑仑0.1 mg/kg麻醉诱导，丙泊酚维持麻醉，气流量为2 L/min。七氟醚1组和丙泊酚1组术中根据引流量、尿量等计算液体损失量，以等量乳酸钠林格氏溶液补充，分别于手术结束即刻采集颈内静脉血15 mL，置于含肝素钠的真空采血管。对照1组于手术麻醉前采集颈内静脉血15 mL，置于含肝素钠的真空采血管。所有标本离心后留取血清，-70 ℃保存。

1.3 细胞增殖抑制率检测 将SHG-44细胞接种于含10% FBS的RPMI 1640培养基，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养，每2～3天按1∶2传代1次。取传3代对数生长期SHG-44细胞，接种于6孔板中，随机分为对照2组、七氟醚2组、丙泊酚2组。各组常规培养12 h，分别加入上述制备的含药血清200 μL继续培养。分别于培养24、48、72 h，加入CCK-8溶液10 μL，再培养2 h。另设空白孔，仅加入等量的CCK-8溶液。酶标仪于450 nm波长处检测各孔的光密度(OD)值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率(%)=(实验孔OD450值-空白孔OD450值)/(对照孔OD450值-空白孔OD450值)×100%。实验重复3次，取平均值。

1.4 细胞侵袭能力检测 取传3代对数生长期SHG-44细胞，随机分为对照2组、丙泊酚2组、七氟醚2组，每组1×104个，分别加入添加插件的Transwell小室上室，插件内为低浓度血清培养基，Transwell小室下室加入高浓度血清培养基，然后在Transwell小室上室插件内加入相应含药血清200 μL，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。培养24 h，取出插件，用湿棉签轻轻擦去插件表面的Matrigel凝胶和聚碳酸脂膜表面的细胞后，甲醇固定，1%结晶紫染色。显微镜下随机选择5个400倍视野，计数穿膜细胞数。实验重复3次，取平均值。

1.5 细胞迁移能力检测 取传3代对数生长期SHG-44细胞，接种于6孔板，随机分为对照2组、丙泊酚2组、七氟醚2组，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。待细胞融合基本铺满板底，用1 mL移液器枪头尖端在每孔表面作一条过孔心的直线，PBS彻底漂洗，吸取细胞碎片后，显微镜下拍照。然后各孔分别加入相应含药血清200 μL，继续培养24 h，显微镜下拍照。采用Image J软件测量细胞划痕间距。细胞迁移率=(初始距离-最后距离)/初始距离×100%。实验重复3次，取平均值。

1.6 细胞周期检测 取传3代对数生长期细胞，接种于6孔板，每孔2×105个，随机分为对照2组、丙泊酚2组、七氟醚2组，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。培养24 h，各组分别加入相应含药血清200 μL。继续培养48 h，收集细胞，冷PBS洗涤，1倍缓冲液重悬，调整细胞悬液密度为1×106/mL。取细胞悬液100 μL至5 mL离心管中，再加入Annexin V-PE 5 μL和7-AAD 5 μL，25 ℃、黑暗环境下孵育15 min，然后加入1倍缓冲液400 μL，1 h内上流式细胞仪检测。检测结果采用ModFit软件分析。

1.7 NF-κB 、Cyclin D1蛋白表达检测 采用蛋白芯片技术。取传3代对数生长期细胞，接种于6孔板，每孔2×105个，随机分为对照2组、丙泊酚2组、七氟醚2组，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。培养24 h，收集细胞，各组加入Full moon芯片专用细胞裂解液100 μL充分裂解，抽提细胞总蛋白，- 80 ℃保存。各组取细胞总蛋白25 μg，加入Labeling Buffer至总体积67 μL，按照配套提供的杂交标准流程和试剂盒进行芯片洗涤与检测。在培养皿中加入封闭液30 mL，完全浸没蛋白芯片。将培养皿置于摇床上，55 r/min室温封闭45 min，Milli-Q水洗涤；然后将芯片置于干净的培养皿中，缓慢将6 mL Protein Coupling Mix滴加到芯片表面。完全浸没芯片，盖上Coupling Chamber，35 r/min室温摇床上反应2 h。取出芯片，干燥后扫描。采用GenePix Pro6.0软件分析结果。

2 结果

2.1 各组培养不同时间细胞增殖抑制率比较 见表1。

表1 各组培养不同时间细胞增殖抑制率比较

注：与对照2组比较，*P<0.05；与丙泊酚2组比较，#P<0.05。

2.2 各组细胞迁移、侵袭能力比较 见表2。

表2 各组细胞侵袭、迁移能力比较

注：与对照2组比较，*P<0.05；与丙泊酚2组比较，#P<0.05。

2.3 各组细胞周期变化 见表3。

表3 各组不同细胞周期所占比例比较

注：与对照2组比较，*P<0.05；与丙泊酚2组比较，#P<0.05。

2.4 各组Cyclin D1、NF-κB蛋白表达比较 见表4。

表4 各组Cyclin D1、NF-κB蛋白相对表达量比较

注：与对照2组比较，*P<0.05；与丙泊酚2组比较，#P<0.05。

3 讨论

丙泊酚是临床广泛应用的静脉麻醉药物，其起效迅速，可用于麻醉诱导及麻醉维持[5～7]。有研究发现，丙泊酚用于神经外科手术可起到一定脑组织保护作用[8,9]，但过量使用可能导致心脏或呼吸抑制[5,10,11]。七氟醚主要通过呼吸道及肺部代谢，无刺激性，临床常用于呼吸麻醉诱导。有研究发现，七氟醚在体外可抑制肺癌细胞增殖和迁移[3]。因此，麻醉方法或麻醉药物可能对肿瘤患者术后复发、生存和转归有一定影响[4]，采用对肿瘤细胞增殖和侵袭有一定抑制作用的麻醉药物或麻醉方法，有可能减少肿瘤细胞在手术期间转移、播散，从而达到降低肿瘤复发或转移概率。

本研究直接从颈内静脉采集静脉血，制备丙泊酚、七氟醚含药血清，在体外干预SHG-44细胞，比较接近麻醉药物在体内代谢过程中产生的药理效应[12，13]。本研究通过细胞增殖、迁移和侵袭实验发现，七氟醚2组可明显抑制SHG-44细胞增殖、侵袭和迁移能力，而丙泊酚2组与对照2组SHG-44细胞增殖、侵袭和迁移能力比较差异无统计学意义。因此，对同样可以使用七氟醚、丙泊酚麻醉时，手术麻醉应优先考虑七氟醚，以减少胶质瘤术中播散的风险。本研究还发现，七氟醚2组G0/G1期SHG-44细胞所占比例明显高于对照2组和丙泊酚2组，S期、G2/S期细胞所占比例明显低于对照2组和丙泊酚2组，而对照2组与丙泊酚2组G0/G1期、S期、G2/S期细胞所占比例比较差异均无统计学意义。提示七氟醚具有一定细胞周期阻滞作用，可抑制SHG-44细胞进一步分裂增殖。

Cylin D1属于细胞周期蛋白家族成员之一，主要功能是促进细胞增殖。Cyclin D1通过结合并激活G1时期特有的周期蛋白依赖性激酶CDK4，G1期周期抑制蛋白(Rb)被磷酸化，磷酸化的Rb蛋白从其所结合的E2F转录因子上解离，E2F转录因子起始转录细胞周期相关基因，从而推动细胞周期由G1期进入S期。NF-κB作为转录调节因子，可由DNA损伤在内的多种因素激活上调，对肿瘤细胞的生长具有重要作用，在多种实体肿瘤细胞中均可见NF-κB激活上调。研究表明，NF-κB在细胞DNA损伤中具有抵抗修复的作用[14，15]。本研究结果显示，七氟醚2组Cylin D1、NF-κB蛋白相对表达量均明显低于对照2组和丙泊酚2组，而对照2组与丙泊酚2组Cylin D1、NF-κB蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义。结果表明，七氟醚可能通过下调Cylin D1、NF-κB蛋白表达来抑制SHG-44细胞的生物学行为。

综上所述，七氟醚含药血清可抑制SHG-44细胞的生物学行为，其作用机制可能是通过下调Cyclin D1、NF-κB表达实现的。对同样可以使用七氟醚、丙泊酚麻醉时，手术麻醉应优先考虑七氟醚，以减少胶质瘤术中播散的风险。