黄芪赤风汤对大鼠胶原诱导性关节炎的治疗作用

谷雨龙，朱丹，柏冬，张立石

(1 中央民族大学民族医药教育部重点实验室，北京100081；2 中国中医科学院中医基础理论研究所)

类风湿关节炎是一种以慢性侵蚀性关节病变为特征的全身性自身免疫性疾病，属于中医“痹证”范畴。黄芪赤风汤出自清代王清任《医林改错》，由黄芪、赤芍和防风组成，“此方治诸病皆效者，能使周身之气通而不滞，血活而不瘀，气通血活，何患疾病不除”。基于文献多元分析的类风湿关节炎用药规律研究认为，黄芪是治疗类风湿关节炎骨破坏使用频次最高的单味药[1，2]。现代药理学研究表明，黄芪的有效成分包括黄芪总皂苷、黄芪总黄酮，黄芪总皂苷可抑制滑膜成纤维细胞增殖，黄芪总黄酮可通过免疫调节作用发挥关节保护作用[3]；防风色原酮是防风的有效成分之一，具有镇痛和抗炎作用[4，5]；赤芍单萜苷是赤芍的有效成分之一，具有抗炎、镇痛、免疫调节等作用[6，7]。基于其有效成分的药理作用，我们推测黄芪赤风汤可用于治疗类风湿关节炎。2017年12月～2018年7月，我们观察了黄芪赤风汤对早期类风湿关节炎的治疗作用，旨在为其临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠60只，SPF级，6周龄，体质量(180±10)g，由中国食品药品检定研究院提供，动物许可证号：SCXK(京)2014-013。黄芪赤风汤(黄芪60 g、赤芍3 g、防风3 g)，经提取、分离、纯化，得到黄芪总皂苷与总黄酮、赤芍单萜苷、防风色原酮，各成分按原药材比例混合均匀，最后经真空干燥，所得干燥物即为黄芪赤风汤提取物，由中央民族大学药学院自制。甲氨蝶呤(MTX)，上海上药信谊药厂有限公司。DNM-9602G型酶标仪、DNX-9620A洗板机，北京普朗新技术有限公司。牛Ⅱ型胶原，美国Chondrex公司；弗氏完全佐剂，美国Sigma公司；大鼠TNF-α、IL-1β、IFN-γ ELISA试剂盒，北京德易临床检验所有限公司；大鼠瓜氨酸化组蛋白H3 ELISA试剂盒，美国Epigentek公司。

1.2 动物分组处理 所有大鼠适应性喂养1周，随机分为对照组、模型组、MTX组及黄芪赤风汤低、中、高剂量组，每组10只。模型组、MTX组及黄芪赤风汤低、中、高剂量组参照文献[8]建立胶原诱导性关节炎(CIA)模型，对照组不建模，正常喂饲。CIA模型制备：取适量2 mg/mL牛Ⅱ型胶原溶液逐滴加入等体积弗氏完全佐剂中，使牛Ⅱ型胶原终浓度为1 mg/mL，冰浴中用匀浆器充分乳化；取乳化后的混合物0.2 mL，尾根部皮内注射；注射第10天，取乳化后的混合物0.1 mL，再次尾根部皮内注射。首次皮内注射次日，MTX组给予MTX 0.3 mg/kg灌胃，黄芪赤风汤低、中、高剂量组按人和动物间体表面积折算的等效剂量比值分别给予含黄芪赤风汤生药量7.7、23.1、69.3 g/kg灌胃，对照组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃。MTX组每周一、四灌胃1次，共灌胃6次[9]；其余各组每日灌胃1次，连续灌胃21天。

1.3 相关指标观察

1.3.1 关节炎指数(AI)评分和踝关节直径 模型组、MTX组及黄芪赤风汤低、中、高剂量组分别于首次皮内注射第13、16、19、21天，对照组同时间，按5级评分法进行双后踝关节AI评分，单侧后踝关节最大计4分，双侧最大计8分。AI评分标准：无关节炎计0分；小趾关节轻度肿胀计1分；小趾关节和足跖肿胀计2分；踝关节以下足爪肿胀计3分；包括踝关节在内的全部关节肿胀计4分。模型组、MTX组及黄芪赤风汤低、中、高剂量组分别于首次皮内注射第0、7、13、16、19、21天，对照组同时间，用游标卡尺测量双后踝关节直径。

1.3.2 血清TNF-α、IL-1β、IFN-γ含量 各组末次灌胃24 h，3%戊巴比妥钠静脉麻醉，腹主动脉取血6 mL，3 000 r/min离心20 min，留取上清液，-80 ℃冰箱保存。采用DNM-9602G型酶标仪、ELISA法检测血清TNF-α、IL-1β、IFN-γ。所有操作严格按试剂盒说明进行。

1.3.3 关节滑液瓜氨酸化组蛋白H3含量 腹主动脉取血后，双后肢膝关节内注入无菌生理盐水0.1 mL，反复抽吸混匀，抽尽膝关节腔内液体，3 000 r/min离心20 min，取上清液，- 80 ℃冰箱保存[10]。采用DNM-9602G型酶标仪、ELISA法检测膝关节滑液瓜氨酸化组蛋白H3。所有操作严格按试剂盒说明进行。

2 结果

2.1 各组不同时间AI评分和双后踝关节直径比较 见表1、2。

表1 各组不同时间AI评分比较(分，

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与MTX组比较，△P<0.05；与同组第13天比较，▼P<0.05。

表2 各组不同时间双后踝关节直径比较

注：与对照组同侧比较，*P<0.05；与模型组同侧比较，#P<0.05；与MTX组同侧比较，△P<0.05；与同组同侧第0天比较，▼P<0.05；与同组同侧第7天比较，◇P<0.05；与同组同侧第13天比较，◆P<0.05。

2.2 各组血清TNF-α、IL-1β、IFN-γ含量及关节滑液瓜氨酸化组蛋白H3含量比较 见表3。

表3 各组血清TNF-α、IL-1β、IFN-γ含量及关节滑液瓜氨酸化组蛋白H3含量比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与MTX组比较，△P<0.05；与黄芪赤风汤低剂量组比较，▲P<0.05；与黄芪赤风汤中剂量组比较，▽P<0.05。

3 讨论

目前，我国类风湿关节炎的患病率为0.32%～0.36%，总患病例数逾500万人。由于类风湿关节炎病情进程长且易反复，初期诊断困难，关节损伤后难以修复，最终导致关节畸形，甚至残疾。类风湿关节炎病因仍不明确，一般认为与遗传、环境、感染等因素密切相关。中医认为，类风湿关节炎是以虚实夹杂为主要表现的虚损性疾病，根据其临床表现属于中医“痹证”范畴。《素问·痹论》云：“风寒湿三气杂至，合而为痹也。其风气胜者为行痹，寒气胜者为痛痹，湿气胜者为着痹也。”故类风湿关节炎的病机是素体本虚，正气不足，外感风寒湿邪，痹阻脉络，流注关节，属本虚标实之证。

黄芪赤风汤出自清代王清任《医林改错》，由黄芪二两、赤芍和防风各一钱组成。“此方治诸病皆效者，能使周身之气通而不滞，血活而不瘀，气通血活，何患疾病不除”，方中黄芪补益肺气，赤芍清热凉血、活血祛瘀，防风祛风解表、胜湿解痉止痛。以本方为基础配伍联合其他中药治疗类风湿关节炎已有临床报道[11]。本研究经提取、分离、纯化，得到黄芪总皂苷与总黄酮、赤芍单萜苷、防风色原酮，经现代药理学研究证实，各成分具有抗炎、镇痛、免疫调节等作用。因此推测，黄芪赤风汤可用于治疗类风湿关节炎。

CIA动物模型是观察类风湿关节炎的最佳动物模型，其临床表现、免疫学和免疫机制等均与人类风湿关节炎接近。因此，本课题组选用CIA动物模型作为载体，研究黄芪赤风汤提取物对类风湿关节炎的治疗作用。研究证实，细胞因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ产生的免疫损害是导致类风湿关节炎慢性炎症的关键因素[12]。TNF-α作为促炎性细胞因子在类风湿关节炎发病机制中具有重要作用，可参与内皮细胞的激活、细胞因子的诱导、白细胞的聚集、破骨细胞的活化与软骨的破坏等，继而导致炎性反应持续发生和软骨或骨渐进性破坏。IL-1β是最强的骨吸收剂，可直接增强破骨细胞骨侵蚀吸收能力，导致骨的破坏；局部IL-1β水平升高可抑制软骨修复，并与TNF-α具有协同增强作用。IFN-γ在细胞免疫应答过程中合成，是一种免疫调节剂，通过诱导多种细胞因子的表达促发炎症[13]。早期类风湿关节炎患者血清及关节滑液瓜氨酸化蛋白含量明显升高，是一个敏感的生物标志物[14]。瓜氨酸化蛋白主要包括瓜氨酸化纤维蛋白原、瓜氨酸化波形蛋白、瓜氨酸化组蛋白、环瓜氨酸肽等，是由肽基精氨酸经肽酰精氨酸亚氨酶催化脱去亚氨基转变而成[15]。有文献报道，瓜氨酸化组蛋白是免疫应答的抗原靶标，可启动类风湿关节炎相关炎症的起始和传播[16，17]。

本研究结果显示，CIA动物模型建立第13天，模型组AI评分和双后踝关节直径较对照组明显增加，表明成功建立了类风湿关节炎动物模型。在AI评分方面，与模型组比较，MTX组各时间点AI评分均明显降低，黄芪赤风汤低剂量组建模第16天AI评分开始明显降低，黄芪赤风汤中、高剂量组AI评分降低不明显；在后踝关节直径方面，与模型组比较，MTX组建模第13天双后踝关节直径明显降低，黄芪赤风汤低剂量组建模第16天双后踝关节直径开始明显降低，而黄芪赤风汤中、高剂量组双后踝关节直径降低不明显。末次灌胃24 h，模型组血清TNF-α、IL-1β、IFN-γ含量及关节滑液瓜氨酸化组蛋白H3含量均明显高于对照组，MTX组和黄芪赤风汤低剂量组上述指标较模型组明显降低。黄芪赤风汤中剂量组血清TNF-α、IL-1β、IFN-γ含量及黄芪赤风汤高剂量组血清TNF-α、IL-1β含量均高于模型组，可能与黄芪的免疫调节作用有关，大剂量应用可增强大鼠免疫功能，导致上述指标明显升高。

综上所述，黄芪赤风汤可用于治疗大鼠CIA，这为其临床治疗类风湿关节提供一定实验依据。