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辐照红细胞输注对肝癌患者CD4+T细胞亚群失衡的影响

2019-01-10任晓亮王冰霜赵学涛曹娜娜

现代中西医结合杂志 2018年36期
关键词:比率孵育外周血

任晓亮,王冰霜,赵学涛,曹娜娜,王 坤,赵 亮

(河北医科大学第四医院,河北 石家庄 050011)

原发性肝癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤,具有较高的发病率和致死率。目前,手术切除仍然是治疗早期肝癌的首选,但总体预后欠佳,可能与抗肿瘤免疫缺陷及细胞免疫功能紊乱有关[1]。由于正常肝组织减少,肝脏合成凝血因子能力降低,导致凝血机制异常,故对于侵犯血管或肿瘤较大的肝癌患者,围术期异体输血(allogeneic blood transfusions, ABT)仍是常用的辅助治疗手段。研究表明,异体血中残留的白细胞及血清中的生物活性分子可能通过输血相关免疫调节 (transfusion-related immunomodulation, TRIM) 进一步抑制肿瘤患者的细胞免疫功能,增加术后感染率及病死率[2]。目前研究发现,经过规定剂量的射线辐照,可使具有免疫活性的淋巴细胞失去植活、增殖的能力,输注辐照血液制品可有效预防输血相关性移植物抗宿主病(transfusion associated graft versus host disease , TA-GVHD)[3], 但对于肿瘤患者细胞免疫功能的影响报道较少。本研究旨在观察输注辐照红细胞对肝癌患者CD4+T细胞亚群分化及相关因子的影响,为其临床应用提供理论依据。

1 临床资料

1.1一般资料 本研究对象为2015年2月—2016年12月来我院接受根治手术的肝癌患者64例,术后均经病理学确诊为肝癌,TNM分期为Ⅰ~Ⅱ期,均无输血史及自身免疫性疾病,术前未接受放、化疗。根据患者术中是否输注辐照悬浮红细胞分为2组:辐照组38例,男17例,女21例;年龄40~69岁;TNM分期Ⅰ期15例,Ⅱ期23例。未辐照组26例,男15例,女11例;年龄43~71岁;TNM分期Ⅰ期10例,Ⅱ期16例。2组患者性别、年龄、TNM分期比较差异均无统计学意义(P均>0.05),具有可比性。本研究经河北医科大学第四医院伦理委员会批准。

1.2输血方法 辐照组输入经137Cs γ射线照射的异体悬浮红细胞,辐照剂量为25 Gy;未辐照组输入普通异体悬浮红细胞。2组患者用血量均为2~4 IU,均为5 d以内CPDA库存悬浮红细胞,未输入血浆等其他血液成分。

1.3观察指标

1.3.1Thl、Th2细胞比率 分别于输血前及输血后14 d采集2组患者外周静脉血5 mL,肝素钠抗凝。取全血样本0.5 mL,加入等量刺激剂(PMA、ionomycin、BFA和RPMI1640),将细胞分别移至实验管和对照管中,加入CD4-PerCP-Cy5.5 10 μL混匀,避光,孵育20 min;加入溶血素1 mL,混匀,避光,孵育10 min,1 500 r/min离心5 min,弃上清;加入破膜剂200 μL,避光,4 ℃孵育20 min,PBS洗涤,离心,弃上清。实验管加入IFN-γ-FITC和IL-4-PE各5 μL,对照管加同型对照抗体,避光,4 ℃孵育30 min。以4%多聚甲醛液固定,流式细胞仪检测Thl、Th2细胞比率。

1.3.2Th17细胞比率 分别于输血前及输血后14 d采集2组患者外周静脉血5 mL,EDTA抗凝,等量PBS缓冲液稀释并混匀,加入Ficoll液分离外周血单个核细胞(PBMC),用含10%胎牛血清的RPMI1640(Gibco公司)重悬细胞。将细胞移至24孔板中,加入PMA、ionomycin、BFA,调整终浓度分别为50 ng/mL、1 μg/mL和10 μg/mL,在37 ℃、5% CO2条件下刺激培养4 h。将细胞移至试管中,分别加入FITC-Anti-Human CD4,同型对照管加入等量同型抗体,避光,4 ℃孵育30 min。用100 μL PBS缓冲液重悬细胞,加入1 mL 固定剂,避光,4 ℃孵育30 min。加入2 mL破膜剂离心弃上清,测定管加入PE-Anti-Human IL-17A,同型对照管加入等量同型抗体,避光,4 ℃孵育30 min。再次洗涤后,以0.5 mL PBS重悬细胞,流式细胞仪检测Th17细胞比率。

1.3.3Treg细胞比率 血样采集及细胞培养同1.3.2。将培养的细胞移至试管中,测定管分别加入FITC-Anti-Human CD4 和 APC-Anti-Human CD25,避光,4 ℃孵育30 min;PBS洗涤后重悬细胞,加入固定剂1 mL,避光,4 ℃孵育30 min;破膜剂2 mL洗2次,用正常大鼠血清封闭15 min,测定管加入PE-Anti-Human Foxp3,同型对照管为等量PE-rat IgG2a,避光,4 ℃孵育30 min;再次洗涤后,以0.5 mL PBS重悬细胞,流式细胞仪检测Treg细胞比率。流式细胞检测所用抗体及相应试剂购于eBioseience公司。

1.3.4外周血细胞因子水平 分别于输血前及输血后14 d采集2组患者外周静脉血5 mL,不加抗凝剂,离心后取血清2~3 mL,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测样本中白细胞介素-2(IL-2)、干扰素-γ (IFN-γ)、IL-4、IL-6、IL-17和IL-10水平。ELISA试剂盒购于深圳晶美公司,实验严格按说明书要求操作。

2 结 果

2.12组患者输血前后外周血Th1/Th2、Th17/Treg细胞比率比较 输血后14 d,辐照组Th1细胞比率、Th2细胞比率、Th1/Th2比值、Th17细胞比率、Treg细胞比率、Th17/Treg比值与输血前比较差异均无统计学意义(P均>0.05);未辐照组外周血Th1细胞比率、Th1/Th2比值、Th17/Treg比值均明显低于输血前及辐照组(P均<0.05),Th2细胞比率、Treg细胞比率均明显高于输血前及辐照组(P均<0.05),2组Th17细胞比率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 2组患者输血前后外周血Th1/Th2、Th17/Treg细胞比率比较

注:①与输血前比较,P<0.05;②与辐照组比较,P<0.05。

2.22组患者输血前后血清细胞因子水平比较 输血后14 d,辐照组血清IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-17及IL-10水平与输血前比较差异均无统计学意义(P均>0.05);未辐照组血清IL-2、IFN-γ水平均显著低于输血前及辐照组(P均<0.05),IL-4、IL-6、IL-17、IL-10水平均显著高于输血前及辐照组(P均<0.05)。见表2。

3 讨 论

表2 2组患者输血前后血清细胞因子水平比较

注:①与输血前比较,P<0.05;②与辐照组比较,P<0.05。

T淋巴细胞是机体免疫功能的重要组成部分。活化CD4+T细胞可进一步分化为Thl、Th2、Thl7和Treg4类亚群,组成Th1/Th2、Th17/Treg两对动态平衡,在机体免疫稳态中发挥重要作用,对抗肿瘤免疫和耐受机制、肿瘤免疫微环境以及恶性肿瘤的发生、发展及预后至关重要[4]。Th1细胞介导细胞免疫,主要分泌IL-2、肿瘤坏死因子(TNF-α)及IFN-γ等,可诱导肿瘤细胞凋亡,抑制血管生成,具有激活抗肿瘤活性的作用;Th2细胞介导体液免疫,主要分泌IL-4、IL-5及IL-6,可抑制细胞免疫,促进肿瘤的转移和复发。其中IL-2、IL-4及IFN-γ相互拮抗维持Th1/Th2平衡。Thl7细胞主要分泌IL-2及TNF-α等多种细胞因子;Treg细胞作为免疫调节性细胞可通过分泌IL-10等细胞因子下调机体肿瘤免疫应答,抑制机体抗肿瘤免疫作用。二者的功能和分化过程相互拮抗维持Th17/Treg平衡。研究发现,在肝癌[5]、非小细胞肺癌[6]、乳腺癌[7]及淋巴瘤[8]等恶性肿瘤中存在Th1细胞比例减少,相关细胞因子表达降低,Th2细胞因子呈优势表达的失衡现象,并且随着肿瘤恶性程度增加偏移更加明显。Ormandy 等[9]发现原发性肝癌患者存在Treg细胞的过量表达,而Treg细胞的增加及功能增强可促进肿瘤细胞侵袭与转移,影响预后[10]。目前,由于Th17细胞因子来源的多样性,作用机制也较复杂,在肿瘤中的效应功能至今尚存争议[11]。

本研究中,输血后14 d辐照组Th1细胞比率、Th2细胞比率、Th1/Th2比值、Th17细胞比率、Treg细胞比率、Th17/Treg比值及血清IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-17、IL-10水平与输血前比较差异均无统计学意义;未辐照组外周血Th1细胞比率、Th1/Th2比值、Th17/Treg比值和血清IL-2、IFN-γ水平均明显低于输血前及辐照组,Th2细胞比率、Treg细胞比率及血清IL-4、IL-6、IL-17、IL-10水平均明显高于输血前及辐照组。说明输注辐照血对肝癌患者CD4+T细胞的免疫功能影响较小。本研究未能对IL-17细胞的详细来源进行流式分析,Th17细胞比例总体呈下降趋势,但差异无统计学意义。

既往研究显示,同种异体输血对肿瘤患者的特异性和非特异性免疫均有明显抑制作用,可增加肿瘤的复发率[12],缩短患者的术后生存期[13]。Bilgin等[14]认为,血液中引起免疫抑制的主要成分是白细胞和血浆,输去白细胞异体血的患者术后感染率及病死率均低于未去白组。本课题组之前研究中发现,输全血及血浆的肝癌患者外周血中Treg 细胞比输洗涤红细胞的患者明显增高,提示与输注供者的白细胞和血浆成分有关[15]。

本研究结果显示,输辐照血液制品可避免上述风险,并可降低输注普通红细胞对肿瘤患者免疫功能的抑制作用,值得推广使用。

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