口蹄疫和水疱性口炎检测方法研究进展

李冰玲,刘艳华,李炎鑫,史喜菊,刘全国,徐立伟

(北京检验检疫技术中心,北京 朝阳 100026)

口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)与水疱性口炎(Vesicular stomatitis,VS)在临床症状上十分相似,无法通过临床诊断进行区分,因此用实验室方法对两种疾病进行鉴别诊断和病毒分型就变得十分重要。此外,动物可能由于易感性较低或者获得部分免疫导致无症状或症状不明显,因此需要建立多种检测方法以对临床病例进行确诊,鉴别感染后康复动物以及无明显临床症状的病例。实验室检测亦可确保对疾病的及时介入和对疫情的有效防控,而通过病毒分型能够确定传播途径以及选择合适的疫苗株。实验室检测结果也是国家制定持续的监测计划以快速识别疫病的入侵、进行运输控制以及实施根除计划以切断传播途径的依据。本文主要介绍几种国际上常用的实验室检测方法及研究进展。

1 基于形态学的鉴别

可依据微核糖核酸属的口蹄疫病毒和弹状病毒属的水疱性口炎病毒在形态学上的不同,通过电子显微镜对大量存在于水疱液和水疱上皮中的病毒粒子进行鉴别。

2 病毒分离

FMD病毒首选的易感细胞为牛胸腺原始细胞,猪、绵羊或小牛肾原始细胞,其他的比较敏感的细胞系如BHK-21和IB-RS-2也可用来进行病毒培养,但是在检测低剂量感染时其敏感性不如上述原始细胞。VS病毒可采用Vero、BHK-21和IB-RS-2细胞进行培养。待培养物上形成细胞病变后,收集培养液即可以进行酶联免疫吸附试验、补体结合试验或者逆转录聚合酶链式反应检测。可进行病毒分离的样品范围很广,包括水疱上皮,食道-咽部分泌液(OP液),奶和血清[1]。

VSV也可以通过接种鸡胚进行分离。将病毒接种到8～10日龄的鸡胚尿囊膜中使其复制,再进行病毒分离。除酶联免疫吸附试验、补体结合试验和逆转录聚合酶链式反应方法外,也可以采用病毒中和试验对细胞培养物或接种鸡胚进行检测,但该方法比较繁琐且费时较长,且前提是可以获得NJ型和IND型的阳性血清[2]。

3 酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)

ELISA检测FMD抗原可检测来自水疱的样品,以及通过细胞或组织培养进行扩增后的其他部位的样品。常用于检测FMDV抗体的阻断ELISA和竞争ELISA,都是采用型特异性多克隆抗体或单克隆抗体,便捷快速,敏感性高,并且无需活病毒和细胞培养。感染FMDV后血清中会迅速产生抗体,ELISA方法可以通过对几种抗体(IgM,结构蛋白(Structural protein,SP)抗体,非结构蛋白(Nonstructural protein,NSP)抗体的联合检测估计个体或群体的感染程度和感染时间。近几年建立起的IgA检测方法可检测正在进行的病毒复制,可分辨出康复期动物是否是病毒携带者,并且可以区分感染和疫苗接种。近年来关于ELISA方法检测FMDV的研究很多,在抗原检测方面,Morioka等(2014)报道了一种新型的直接 ELISA,其表现优于传统的间接ELISA[3]。在抗体检测方面,有采用重组抗原代替病毒抗原的研究报道[4];Chen等(2013)建立了非结构蛋白抗体的化学发光试验[5]。

ELISA方法也可用于检测动物血清中的VSV抗体。用印第安纳血清型的3种亚型的代表毒株制备的兔或者豚鼠多价抗血清,可以鉴别出水疱性口炎病毒印第安纳血清型的所有毒株。而对水疱性口炎新泽西血清型的鉴别则需要兔或者豚鼠的单克隆抗体[2]。用竞争ELISA方法检测VSV抗体,单克隆抗体作为竞争抗体比多价抗血清具有更好的特异性,且检测结果也更具有一致性[6]。

4 补体结合试验(Complement fixation test,CFT)

CFT可用于检测FMD和VS。但与CFT方法相比,ELISA方法更具有优越性。在大多数实验室,ELISA已经替代CFT,因为ELISA更加敏感和特异,并且不受前补体因子和抗补体因子的影响。在不可获得ELISA试验所需试剂的时候,可以采用CFT。CFT也可被用来对早期产生的抗体进行定量,主要是IgM抗体。CFT适用的检测样品包括水疱上皮悬液、水疱液或细胞培养物上清液,但其敏感性不适合于OP样品或血清的直接检测[1-2]。

5 逆转录聚合酶链式反应(Reverse transcriptionpolymerase chain reaction,RT-PCR)

RT-PCR方法是OIE推荐的用于FMD临床病例确诊的方法之一,也可用于VS临床病例的确诊。与普通RT-PCR相比,实时荧光RT-PCR更适合大批量的样品检测;而与病毒分离方法相比,该方法敏感性更高,但不能检测出病毒是否具有感染性。

该方法可检测的FMD样品包括上皮、奶、血清和OP液中的病毒基因组片段[1]。Vangrysperre和De Clercq(1996)建立了用型特异性引物对FMDV进行分型的RT-PCR方法[7]。目前在很多实验室广泛应用的是更加便捷的一步法实时荧光PCR。

RT-PCR适用的VS样品包括组织、水疱液和病毒培养物,该方法仅用于出现VS临床症状的病例的诊断,并不是对VS进行筛查的常规方法。该方法的阳性检测结果有诊断意义,阴性结果并不代表动物未感染,而可能是由于感染阶段、感染程度、样品状态等原因导致的检测结果阴性。

由于多重RT-PCR方法具有敏感、快速的特点,并且该方法可对不同的病毒、同种病毒的不同血清型进行区分,目前已成为国内外相关实验室的研究热点。William C.(2009)和Kate Hole(2010)分别建立了可以区分水疱性口炎NJ型和IND型病毒的多重实时荧光RT-PCR[8-9]。Jovita Fernandez(2007)建立了可以区别诊断口蹄疫、猪水疱病和水疱性口炎的三重实时荧光RT-PCR[10]。

6 试纸条方法(Lateral flow devices,LFDs)

试纸条方法适用的检测样品有水疱上皮悬液、水疱液或细胞培养物上清液,但是其敏感性不足以用于OP样品或血清的直接检测。

目前已经有一些商品化的检测FMDV病原的试纸条,也有可以检测和区分FMDV的O型、A型和Asia-1型的试纸条。尽管试纸条方法尚未经过OIE的方法确认程序,但该方法简便、快速,便于田间检测,其应用将使那些实验室资源不足的国家受益匪浅。试纸条方法还可以将FMDV病原以一种干燥、无风险的状态运输到实验室,用于核酸扩增、测序和病毒复苏等,以进行进一步的诊断。

Ferris等(2012)采用单克隆抗体C1和F25VSVNJ-45分别建立了检测水疱性口炎IND型和NJ型的试纸条方法,该试纸条可以检出VSVIND-1亚型和 VSV-NJ亚型,但不与 VSV-IND-2和VSV-IND-3亚型反应,也不与口蹄疫病毒和猪水疱病病毒反应[11]。

7 逆转录环介导等温扩增(Reverse transcriptionloop mediated isothermal amplification,RT-LAMP)

RT-LAMP方法的建立是分子诊断技术的重大进展。RT-LAMP快速、简便、经济,其敏感性和特异性与RT-PCR相当,且可在便携式设备上进行,方便田间快速诊断。目前已有多个实验室建立了检测FMDV单个或多个血清型的RT-LAMP方法。Fowler等(2016)建立了检测VSV-NJ型病毒的RT-LAMP方法[12]。

8 其他方法

使用特异性引物,然后用扩增出的病毒RNA产物进行测序,就可以得到该毒株的序列信息。测序方法不仅可以测出主要感染毒株的核酸序列,也可以测出样品中少量变异株的核酸序列。对核酸序列的测定可以了解宿主内病毒的进化和选择过程,从而进一步了解FMDV在宿主体内的动态,并可以在疫病爆发时迅速找到匹配的疫苗。Logan等(2014)建立了一种对FMDV全基因组的实验室大规模测序方法[13]。

使用适当标记的引物,RT-PCR和RT-LAMP的产物可以用试纸条方法来检测。有研究表明,FMDV气体样品和上皮悬液样品都可以用RT-LAMP/LFDs联合方法检出,该联合方法灵敏度非常高,且不需要进行前期的RNA提取,进一步简化了试纸条检测方法的流程[3]。

红外热成像是利用口蹄疫的急性热性的发病特点,筛选出可疑动物进行实验室诊断,适用于不同环境下的健康或患病动物群体的田间筛选。但该方法的结果是非特异性的,需要进行进一步的诊断。

酶联免疫电转印(Enzyme-linked immunoelectrotransfer blot,EITB)方法作为一种检测FMD的血清学检测方法在OIE诊断手册中也有描述。该方法用重组非结构蛋白3A,3B,2C,3D和3ABC来检测待检血清,在南美作为疫情监测中的确诊方法[1]。

9 展望

没有有效的检测方法就谈不上对疫病的有效控制。应根据不同目的选择合适的检测方法。同一方法在应用于不同目的时,对结果的解释也可能会不同。不同方法的结合使用可以提高检测结果的准确性。

口蹄疫和水疱性口炎的检测技术还在不断的进步中,不断发展的分子生物学方法和基因检测技术,以及新的分析方法都将有益于检测技术的发展。目前一些检测方法的费用、易操作性和生物安全方面的需求使一些实验室无法开展更多的检测技术。国内由于缺乏水疱性口炎的血清学诊断试剂,免疫学诊断方法的建立和应用也受到很大制约。因此,在资源不足的实验室建立简便经济的检测方法应该是目前的首要任务。对简便有效的试纸条方法、敏感快速的RT-PCR方法和更加简单经济的RT-LAMP方法的进一步发展和完善,将是口蹄疫和水疱性口炎检测方法研究的重要方向。