动物疫病病毒样颗粒疫苗的研究进展

刘 萍，郭富城，李林杰，李凌浩，马晓霞，马忠仁*

(1.西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃兰州730030；2.甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃兰州730030；3.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州730030)

病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs)是由病毒结构蛋白组成的空心颗粒，具有天然病毒粒子形态和空间结构，但不含有病毒核酸，无感染能力，也不能自主复制[1-2]。许多病毒的结构蛋白在异源系统内重组表达即可自装配形成VLPs，这些VLPs 的形态和结构与真正的病毒粒子相似，大小介于15 nm～400 nm，具有天然病毒粒子的空间构象和与天然病毒相似的免疫原性。机体免疫系统能够高效识别VLPs 并产生特异的细胞免疫、体液免疫及黏膜免疫等免疫应答[2]。VLPs 在结构上允许外源基因或基因片段插入，将其它病原诱导的中和抗体的抗原表位展示在VLPs 表面，形成嵌合型VLPs，因此也可以作为各类疾病新型疫苗的展示平台，目前VLPs 已成为研究热点[3]。另外，VLPs 还具有包裹核酸或经表面修饰后携带其它分子的能力，作为一种潜在的基因或药物的投递工具，具有广阔的应用前景[4]。本文对VLPs 的抗原特性、制备及其在重要动物疫病疫苗的研究和应用进行综述。

1 VLPs的抗原特性

不同病毒来源的VLPs其结构与亲本病毒在形态大小和结构上高度相似，例如结构较为简单的细小病毒、圆环病毒、戊型肝炎病毒等的VLPs 由1 种或2 种结构蛋白组成；而流感病毒、艾滋病病毒和丙型肝炎病毒等的VLPs具有来自宿主细胞的脂质膜结构以及经糖基化修饰的病毒纤突蛋白。因此，VLPs 具有与天然病毒类似的病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMP)，能够与天然免疫系统中的模式识别受体结合，激活天然免疫反应。VLPs 的体积较小，容易通过淋巴管进入淋巴结中。在淋巴结，VLPs 可以被定居于淋巴结中的树突状细胞(Dendritic cell，DC)摄取[5]。DC 是机体内功能最强大的专职性抗原递呈细胞(Antigen presenting cell，APC)。VLPs高度有序的表位结构和纳米量级的粒径有利于DC 的吞噬和抗原加工处理。VLPs 能够促进DC 的增殖，上调CD40、CD80、CD86 等表面标志物的表达水平，同时上调主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ和Ⅱ类分子的表达水平，有效提呈抗原。VLPs 上的B 细胞表位与MHC-Ⅱ类分子结合，刺激活化B 淋巴细胞，诱导机体产生特异性中和抗体；T 细胞表位由MHC-I 类分子提呈，能够活化CD8+T 细胞，活化的CD8+T细胞(CTL)可以直接杀死被病原感染的细胞从而清除病毒或其它细胞内寄生的病原体，VLPs 也能够促进IL-6、IL-10、MIP-1α 及TNF-α 等细胞因子的分泌，刺激机体产生细胞免疫应答[6]。

2 VLPs的表达系统

制备VLPs 的重组蛋白表达系统分为真核表达系统和原核表达系统。其中，真核表达系统包括哺乳动物细胞表达系统，酵母表达系统和杆状病毒/ 昆虫细胞表达系统以及植物细胞表达系统等。原核表达系统主要为大肠杆菌表达系统。目前已报导的VLPs 约70 %由真核表达系统制备，约30 %由原核表达系统制备。

2.1 哺乳动物细胞表达系统 制备与人类或动物疾病密切相关的病毒的VLPs 是人们最关注的热点问题。这些病毒是以人或动物的细胞为天然宿主进行复制和增殖。哺乳动物细胞具有最完善的病毒蛋白质翻译和翻译后修饰系统，能够精确地完成糖基化、磷酸化、二硫键形成、蛋白质折叠与空间构象的形成等翻译后加工过程，产生的病毒蛋白具有完整的结构和功能，有利于VLPs 的高效包装，并保证VLPs 的活性。哺乳动物细胞表达系统的这一优点使其被大量应用于疫苗和治疗性重组蛋白的研究和生产中[7]。中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是该系统最常用的表达细胞。目前人用乙肝疫苗GenHevac BⓇ、BioHepⓇ(Sci-B-VacTM)和HepacareⓇ均是在CHO 中表达制备的。哺乳动物细胞表达系统也存在一些不足之处：生产成本较高，目的蛋白表达量低，表达外源蛋白的稳定性不足等。在实际生产中，通过改进生产工艺，降低生产成本，提高目的蛋白表达水平，是相关企业和研究者需要解决的最大问题。

2.2 酵母表达系统 酵母表达系统是一种应用广泛的重组蛋白真核表达系统，也被应用于VLPs 的制备。毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和汉逊酵母(Hansenula yeast)是常用的酵母细胞，可以对表达的蛋白进行翻译后修饰以使其具有正确的构象和生物活性，但酵母的翻译后修饰功能有限，特别是蛋白糖基化的不足，常用于无囊膜VLPs 的制备。Merck 公司采用酵母表达系统开发出了乙型肝炎病毒(HBV)和人乳头瘤病毒(HPV)VLPs 疫苗。酵母细胞也具有同时表达多种亚单位蛋白，并将其组装成VLPs 的能力，例如同时表达轮状病毒的3 种结构蛋白，并将其组装成多层VLPs[8]。

2.3 杆状病毒/ 昆虫表达系统 杆状病毒/ 昆虫表达系统是近年来广泛应用的高效表达外源蛋白的真核表达系统之一。杆状病毒具有严格特异的感染嗜性，只能感染昆虫细胞，对脊椎动物不致病，也不产生内毒素，不存在生物安全问题；基因组较大，可以容纳较大片段的外源基因，蛋白大都以可溶性表达，表达效率高；高表达的外源蛋白在昆虫细胞内可以进行与哺乳动物细胞几乎相同的折叠、二硫键形成、糖基化、磷酸化、酰基化、信号肽切除及肽段的切割等，使重组蛋白具有良好免疫原性；此外，昆虫细胞还可以高密度悬浮连续培养，容易扩大生产规模，适合于重组蛋白的工业化生产。因此，杆状病毒/ 昆虫表达系统制备各种类型VLPs 的优势使其成为疫苗开发者最新关注的VLPs 表达系统。基于该系统，葛兰素史克公司已经成功开发出人用HPV16 型和18 型VLPs 疫苗CervarixⓇ，并于2009年得到美国食品和药物管理局(FDA)批准。用该系统制备VLPs 疫苗也存在一些潜在的问题，即制备的VLPs 颗粒大小与杆状病毒粒子类似，二者存在共表达，容易被污染，因此，纯化是该系统制备VLPs 疫苗所面临的最大挑战[9]。

2.4 大肠杆菌表达系统 大肠杆菌(E.coil)表达系统是目前制备重组蛋白最广泛的表达系统，也可以用来表达一些无囊膜病毒的结构蛋白，并组装形成VLPs。目前，利用大肠杆菌表达系统制备VLPs 的技术已经比较成熟。该系统的一个特点是表达量大，外源蛋白常常以包涵体形式存在。制备VLPs 需要对包涵体复性，研究者更多的是利用低温培养，或通过引入分子伴侣蛋白SUMO 的策略促使目的蛋白以可溶性的方式表达，以便VLPs 的高效组装。在大肠杆菌表达系统中也可以同时表达多个结构蛋白实现多层蛋白VLPs 的共组装[10]。由于大肠杆菌内没有与真核细胞类似的蛋白质翻译后修饰系统，因此不适合用于表达需经翻译后修饰的形成VLPs 的亚单位蛋白，也不能用于有囊膜VLPs 的生产[10]。值得一提的是，全球首个成功上市的戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)疫苗的抗原就是由大肠杆菌表达系统表达其E2 蛋白N 端部分制备的VLPs。

3 动物用VLPs疫苗的研究进展

VLPs 具有与天然病毒相似的构象表位、可以重复且高密度展示抗原表位，表现更强的免疫原性，能够诱导有效的免疫应答，但又不具有感染性，比减毒活疫苗和灭活苗安全，比其他类型亚单位疫苗更有效。随着人用的HPV、HBV、H9N2 流感病毒及基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV)等的VLPs 疫苗成功上市，用于动物疫病预防的VLPs 疫苗的研究也不断取得突破性进展。

3.1 口蹄疫的VLPs口蹄疫(Foot and mouth disease，FMD)是由FM 病毒(FMDV)引起的偶蹄动物常发的一种烈性传染病，曾多次在世界范围内暴发，严重威胁家畜安全和国际畜产品贸易，OIE 将其列为A 类传染病之首。传统的灭活疫苗仍是当前防控该疫病的主要疫苗。为更好的防控和净化FMD，近年来，利用基因工程技术制备针对FMDV 的新型疫苗，如标记疫苗、复合表位肽疫苗、VLPs 疫苗等取得了一定进展。其中VLPs 疫苗显示出良好的应用前景。Cao 等较早尝试了以重组杆状病毒为载体将O 型和亚洲I 型FMDV 的P1、2A、3C 基因在High Five 昆虫细胞中表达，该几种蛋白能够自我组装形成与亲本病毒粒子大小相同的VLPs，具有一定的免疫原性，但免疫豚鼠未能获得高水平的中和抗体[11]。Li 等同样在昆虫细胞表达了上述3 个FMDV 结构蛋白并成功组装了VLPs。以此VLPs 疫苗免疫牛，通过间接免疫荧光和夹心ELISA 检测到FMDV 特异性抗体，攻毒试验显示，该疫苗半数保护量(PD50)可达6.34/ 头份，超过OIE 规定的标准(3 PD50/ 头份)[12]。Mohana 等将O 型FMDV 的P1、2A、3C 连接到pFastBac 表达载体中，构建的重组杆状病毒在Sf9 细胞中也能表达并组装形成相应的VLPs。将该VLPs与ISA206 佐剂混合后免疫牛，经两次免疫后可以检测到中和抗体，攻毒试验显示，该疫苗每头份合5.01 PD50[13]。利用重组杆状病毒表达系统表达FMD-VLPs 的例子还有很多。这些研究表明，亚洲I 型和O 型FMDV 的P1、2A、3C 蛋白由重组杆状病毒系统表达、组装形成的VLPs 可以作为疫苗。Guo 等也尝试了利用原核表达系统组装FMDV VLPs，研究将亚洲I 型FMDV 的VP1、VP3 和VP0 分别与SUMO 融合使之在大肠杆菌中共表达，这3个结构蛋白在去除SUMO 基团后可以组装形成VLPs。动物免疫试验显示，含50 μg 蛋白的VLPs 单剂量免疫豚鼠、猪和牛即可诱导高水平的免疫应答。对牛的攻毒保护试验结果显示，每头份含50 μg 蛋白的VLPs 疫苗可达到6.3 PD50[14]。这项研究表明，利用原核表达系统表达FMDV 的结构蛋白，也可以组装VLPs，并可以做为候选疫苗。除了构建由FMDV 自身结构蛋白组装的VLPs 的外，嵌合VLPs 也是FMDV 疫苗的一个研究方向。有学者将FMDV 主要保护性抗原或抗原中的B、T 细胞表位与其它病毒自组装成VLPs 的结构蛋白融合表达使其展示于嵌合VLPs 的表面，在免疫动物时能够刺激机体产生针对FMDV 的特异性免疫应答。例如，基于乙肝核心抗原(HBcAg)融合FMDV 全长VP1 组装成的VLPs，相比可溶性的VP1 蛋白，能够更有效刺激小鼠产生高水平的T 细胞增殖和CTL 应答，及中和抗体的产生[15]。

为大规模工业化制备FMDV 的VLPs，研究者也在做大量的工作。Kumar 等将O 型FMDVIND/R2/75 株的P1-2A-3C 蛋白串联，构建重组杆状病毒，将该重组杆状病毒经口或血管腔内注射感染蓖麻蚕幼虫，在感染后3 d～7 d 能够从幼虫血淋巴中获得大量VLPs，且VLPs 产量明显高于该重组杆状病毒感染的SF9 细胞。ELISA 检测显示，从蓖麻蚕幼虫体内获得的VLPs 可以与FMDVIND/R2/75 株的阳性血清反应，再用该阳性血清做western blot检测VLPs，显示在26 ku、37 ku 和47 ku 处有3 条目的条带。采用经蔗糖密度梯度离心纯化的VLPs 免疫兔子和豚鼠，其血清能够与FMDVIND/R2/75 株抗原发生反应，表明该方法能够制备具有免疫原性的VLPs。作者认为以蓖麻蚕幼虫为宿主可以大规模生产FMDV VLPs 疫苗[16]。Xiao 等开发了大肠杆菌共表达系统，在同一个质粒中串联表达FMDV 的3 个衣壳蛋白VP0、VP1 和VP3，共表达的FMDV 衣壳蛋白也可以在10 L 的发酵罐中大规模生产，利用色谱纯化目的蛋白并在体外自组装形成VLPs。单一剂量FMDV VLP 与佐剂混合后免疫牛可以诱导牛产生抗FMDV 的ELISA 抗体和中和抗体，抗体持续期可达6 个月。该VLP 疫苗可以诱导免疫牛产生较好的保护作用，PD50可达到11.75/头份[17]。

3.2 小反刍兽疫的VLPs 小反刍兽疫(Peste des petits ruminants，PPR)是近年来传入我国的一种山羊和绵羊急性、烈性、高度接触性传染病，由PPR 病毒(PPRV)引起，被我国列入一类动物疫病名录，OIE 列为A 类烈性传染病。从事该病原的研究需要生物安全3 级以上的条件设施。VLPs 技术为在普通实验室模拟研究该病原的生物学特性和疫苗研发提供了有力工具。F、H 和N 蛋白是PPRV 的主要保护性抗原，能够刺激机体产生中和抗体，常作为VLPs 疫苗的候选抗原，M 蛋白在PPRV VLPs 的组装过程中发挥关键作用。Wang 等将PPRV 的N、M、H 和F 蛋白在Vero 细胞中表达，这4 种蛋白共表达可以高效的组装和释放VLPs，与病毒自然感染形成自带病毒粒子的效率相当。将M 和F 蛋白共表达也能够有效组装和释放VLPs。但如果无M 蛋白，N、H 和F 单表达或共表达均不能组装和释放VLPs，这表明M 蛋白对于VLPs 的形成至关重要[18]。Liu 等根据昆虫细胞密码子的偏好对M 基因，H 基因进行了密码子的优化，并将它们与N 基因一起构建重组杆状病毒。Western blot 等方法检测到重组杆状病毒在昆虫细胞中共表达这3 种结构蛋白，透射电镜观察到VLPs 穿过细胞膜的出芽过程，纯化后的该VPLs 在形态学上与亲本病毒相似，但粒径较小[19]。他们还将M蛋白和N 蛋白利用杆状病毒表达系统在昆虫中表达，组装出了VLPs，该VLPs 的粒径与由3 种结构蛋白形成的VLPs 类似，在100 nm～150 nm，均明显小于亲本病毒的粒径(400 nm～500 nm)[20]。以由M、H 和N 蛋白组装的VLPs 免疫小鼠2 次，所有免疫小鼠的血清中均可以检测到PPRV 特异性的中和抗体[21]。Li 等对由M、H 和N 蛋白组装的VLPs 进行了小鼠和山羊的免疫试验，结果显示，皮下注射VLPs 能够诱导小鼠产生PPRV 特异性的IgG 和高水平的中和抗体。该VLPs 在不加佐剂单独免疫的情况下与相同剂量的PPRV 弱毒疫苗具有相当的免疫效果。这项研究也提示，VLPs 作为PPRV 疫苗的候选抗原，在净化该疫病时还具有能够区分血清学阳性动物为野毒感染或疫苗免疫的潜力[22]。

3.3 猪繁殖与呼吸综合征的VLPs 我国于2006年暴发高致病性猪繁殖与呼吸综合征(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome，HP-PRRS)，其感染率和死亡率极高，给养猪业造成极大的经济损失。PRRSV变异较快，传统疫苗对其保护性较差，尤其是灭活苗诱导低效价中和抗体时，会发生抗体依赖作用，反而感染程度增强。弱毒苗对HP-PRRSV 保护作用较好，但存在散毒和毒力返强等潜在的缺陷。因此VLPs 可以作为安全有效的PRRSV 新型疫苗的一个发展方向。

Nam 等将PRRSV 的GP5 和M 蛋白利用杆状病毒表达系统成功制备出VLPs，以纯化后的VLPs 免疫Balb/c小鼠，结果显示该VLPs 可以刺激机体的细胞免疫和体液免疫，显著上调IL-4、IL-10、INF-γ 的表达，4.0 μg VLPs的免疫剂量诱导INF-γ 产生的水平显著高于商品化的疫苗对照，在免疫2.0 μg 和4.0 μg VLPs 的小鼠体内检测到中和抗体[23]。Binjawadagi 等利用杆状病毒表达系统构建了包含PRRSV 表面蛋白GP5-GP4-GP3-GP2a-M 或GP5-M 的PRRS-VLPs。为了增强免疫原性，将制备的VLPs 与PLGA 纳米颗粒混合，并与佐剂一起经鼻免疫猪。结果显示，PRRS-VLPs 能够诱导免疫猪产生高水平的IgG 和IFN-γ，免疫猪攻毒后体内IgG 和IFN-γ 水平会再次显著上升，并且PRRSV 在免疫猪肺脏中的载量较对照组低2个数量级，表明PRRS-VLPs 不仅能够诱导记忆性免疫反应，还具有很好的免疫保护效果[24]。也有学者尝试将PRRSV 的保护性抗原表位插入到其它病毒的结构蛋白中构建嵌合型的VLPs 疫苗。例如以H3N2 猪流感病毒(SIV)结构蛋白HA、M1、NA 为基础制备VPLs，融合PRRSV的GP5 构建的H3N2-PRRS 嵌合VPLs 能够诱导针对H3N2 SIV 和PRRSV 的免疫应答[25]。利用HBV 核心抗原(HBcAg)融合PRRSV 的B 细胞、T 细胞表位，在大肠杆菌中也制备了嵌合VLPs，其免疫效果尚需进一步评价[26]。

3.4 猪圆环病毒2 型VLPs 猪圆环病毒2 型(Porcine Circovirus 2，PCV2)在我国猪群中感染比较普遍，主要引起免疫抑制，与其它病原混合感染时，可能会导致猪群大规模发病。PCV2 是一种小型无包膜的单股正链环状DNA病毒，结构简单，基因组含3 个主要的开放阅读框(ORFs)，其中ORF2 编码核衣壳蛋白(Cap 蛋白)。Cap 蛋白是组成PCV2 病毒粒子的唯一结构蛋白，也是该病毒的保护性抗原蛋白。针对Cap 蛋白已经制备了多种PCV2 亚单位疫苗用于该病的预防。勃林格殷格翰以Cap 蛋白开发的PCV2 VLPs 疫苗已经与2013年批准上市，商品名为PCV2 杆状病毒载体灭活疫苗Ingelvac CircoFLEXⓇ，也是首个用于动物疫病预防的VLPs 疫苗。该疫苗以杆状病毒为表达载体，用昆虫细胞表达的Cap 蛋白自组装形成VLPs。

目前，以杆状病毒表达系统制备PCV2 VLPs 的技术已经比较成熟，抗原的免疫效果也很好。为了进一步降低生产成本，研究者也在不断尝试用原核表达系统来制备PCV2 VLPs。Yin 等将完整PCV2 ORF2 与SUMO 融合构建了原核表达载体，实现Cap 在大肠杆菌中的可溶性表达，电镜观察重组Cap 蛋白能够自我组装形成直径17 nm的VLPs[27]。研究表明，在原核系统中，Cap 蛋白N 端核定位区(NLS)、二聚体结构形成有关的中间部分以及Cys108 对VLPs 的组装至关重要。如果编码Cap 蛋白的基因N 端缺失或者二聚化功能域缺失及Cys108 位氨基酸突变均会影响VLPs 的组装[28]。Wu 等将密码子优化的PCV2 ORF2 全长插入表达载体pET-24a 中，在E.coliBL21 (DE3)诱导表达，重组Cap 蛋白的产量可达250 μg/mL，且能够在体外组装成直径25 nm～30 nm 的VLPs，用该VLPs 免疫能够诱导小鼠产生中和抗体和细胞免疫应答[29]。原核表达系统的优点在于操作简易，成本低廉。用该系统制备PCV2 或其它病原的VLPs，将较大降低VLPs 疫苗的制备成本，提高疫苗的产量和生产效率。

3.5 其他重要动物疫病的VLPs 猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是造成妊娠母猪繁殖障碍的病原微生物之一。Ji 等利用原核系统表达PPV 完整的VP2 蛋白，成功获得了VLPs。所获得的VLPs 具有与PPV 相似的大小，形状和血细胞凝集特性。用这些VLPs 免疫可刺激小鼠和豚鼠产生中和抗体。在免疫的豚鼠中也能够诱导淋巴细胞增殖反应和细胞因子分泌，效果与用PPV 灭活疫苗免疫的豚鼠相当。此外，攻毒试验显示用VLPs 免疫也可以显著降低豚鼠脾脏中的PPV 含量[30]。高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza，HPAI)和新城疫(New castle disease，ND)是最具破坏力的家禽传染病，由HPAIV 和NDV 引起。研究者将H5N1 HPAIV 的M1 蛋白以及血凝素(HA)的胞质区和跨膜区与NDV 的F 蛋白的胞外区融合表达，获得的重组蛋白可以自组装形成嵌合VLPs。用嵌合VLPs 单次免疫鸡可诱导产生高水平的HA 特异性抗体，也能检测到抗NDV 的抗体，并对鸡随后的HPAIV 和NDV 感染具有保护作用[31]。裂谷热(Rift Valley fever，RVF)是由RVF 病毒(RVFV)引起的，由节肢动物传播的急性发热性人畜共患疾病，在非洲和阿拉伯半岛盛行，并造成重大的经济损失。利用杆状病毒pFastBacDual 表达系统，将RVFV 的N 和G 蛋白在Sf9 昆虫细胞中共表达，获得了RVFV VLPs。透射电镜显示RVFV VLPs 的形态与RVFV 粒子一致，且具有一定的免疫原性，这为未来基于VLPs 的RVFV 疫苗研究奠定了基础[32]。蓝舌病毒(Bluetongue virus，BTV)是小反刍动物蓝舌病的病原，具有多种血清型。Stewart 等利用杆状病毒表达系统组装出BTV血清型8 (BTV-8)的VLPs，用BTV-8 VLPs 免疫阿尔卑斯山羊可产生BTV-8 特异性中和抗体，用BTV-8 强毒株攻毒，所有接种VLPs 的动物都没有BT 或病毒血症的临床表现，这表明BTV VLPs 是安全有效的免疫原[33]。

4 展 望

VLPs 的结构特征使其能够有效刺激机体产生体液和细胞免疫应答，免疫原性优于未正确折叠和修饰的可溶性重组亚单位疫苗。与减毒活疫苗相比，VLPs 不表达调控宿主免疫机能的病毒蛋白，不存在散毒和毒力返强的潜在风险，生物安全性好。与灭活疫苗相比，其生产工艺简单，成本更低。这些优势使得VLPs 成为开发新型疫苗的热点和趋势。许多动物病毒的VLPs 也已经作为一个开放的平台，通过融合异源抗原表位基因，将抗原整合至VLPs 用于多价疫苗研制。另外，VLPs 作为诊断用抗原和小分子药物投递方面也显示出了广阔的应用前景[34]。相信随着技术的不断进步和研究的不断深入，将会有更多新型兽用VLPs 疫苗成功上市并投入应用，VLPs 作为有效的重组疫苗平台，其发展也会日趋成熟。