沙门氏菌诱导鸡生殖道产生免疫反应的研究进展

胡庆花，马 跃，单春兰，张美玲，孙播东，王凤娇，栾维民,2，杨树宝*

(1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118；2.吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，吉林长春130118)

沙门氏菌可以通过鸡蛋(胚)造成垂直传播，给家禽养殖带来严重的经济损失，同时沙门氏菌还是引起人类食源性疾病的主要病原菌之一，许多国家出现了由沙门氏菌污染的禽蛋、禽肉等禽类产品造成的食品安全问题[1]。有些血清型的沙门氏菌还是人畜共患性沙门氏菌，可以使人类出现某些疾病。家禽感染沙门氏菌可以分为两种类型：一种是人畜共患性沙门氏菌即肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)和鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)，另一种是家禽特异性沙门氏菌包括鸡伤寒沙门氏菌(S.gallinarum)和鸡白痢沙门氏菌(S.pullorum)。其中SE 和ST 是最容易引起家禽感染的副伤寒沙门氏菌，它们可以对人类和其它动物健康造成威胁，是引起人类食源性疾病的主要病原体，可以使患者出现腹泻、发热、腹痛或痉挛、呕吐、头痛等典型症状。当SE 和ST 感染鸡肠道和鸡生殖道后，被感染鸡会出现腹泻，产蛋量下降等症状。现如今已经基本排除了家禽特异性沙门氏菌对家禽的感染，仍然较为流行的还是人畜共患性沙门氏菌疾病。目前，对鸡生殖道免疫方面的研究相对较少，只有少数学者对鸡感染SE 后，生殖道的获得性免疫应答情况进行研究。当沙门氏菌定植于输卵管之后，可以一直寄居在生殖道并且会对新鲜的鸡蛋造成污染。据报道阴道免疫相比于输卵管其它部位免疫更为重要，因为泄殖腔处排泄物和环境中的SE 可以经过阴道进入输卵管上段随后可能引起鸡蛋的污染[2-3]。Gantois 等也发现当SE 感染鸡的阴道、峡部和漏斗部后，所形成的鸡蛋中蛋壳、蛋膜和蛋白中也会存在SE[1]，因此保护鸡的输卵管，尤其防止鸡的阴道感染对阻止病原微生物进入刚形成的鸡蛋和成功受精是非常有必要的。机体的免疫系统和生殖系统可以相互作用，它对动物的生育能力和生殖道健康有重要影响[4]，免疫系统功能的发挥主要是通过天然免疫应答和获得性免疫应答来实现。当鸡生殖道感染沙门氏菌后，生殖道中天然免疫应答成分，包括Toll 样受体(Toll-like receptors，TLRs)，鸡β-防御素(AvβDs)的表达和天然免疫细胞如巨噬细胞等可能会出现一些变化，而获得性免疫成分如淋巴细胞数量和分布，一些细胞因子的表达上也会有所改变。因此为了更有效的预防鸡生殖道疾病尤其是肠炎沙门氏菌性疾病，高度重视鸡生殖道免疫是十分必要的。

1 鸡生殖道相关淋巴组织概述

生殖道相关淋巴组织是粘膜相关淋巴组织重要组成部分，对鸡而言，其没有外周淋巴结，所以粘膜相关淋巴组织是其主要的次级免疫器官，对禽类起到免疫保护的作用。T 细胞和B 细胞作为粘膜相关淋巴组织中重要的免疫细胞将参与生殖道粘膜免疫反应。利用组织学实验方法证明在鸡输卵管中存在较多分散的淋巴细胞和少数淋巴集结，而且主要分布于粘膜上皮和上皮周围的粘膜固有层中[5]。也表明淋巴组织在生殖道局部免疫中起关键作用。Hrabia等对成熟母鸡生殖道中B 淋巴细胞分布情况进行观察，结果显示B 淋巴细胞散布在母鸡输卵管中，而卵巢中分布较少，且IgM+和IgA+B 淋巴细胞明显多于IgG+。而卵巢和输卵管中均存在T 细胞，且在输卵管局部以淋巴细胞聚集物形式存在[6]。

2 鸡生殖道淋巴组织对沙门氏菌感染产生的天然免疫应答

禽类卵巢和输卵管易受病原微生物侵害， 宿主天然免疫反应对维持禽类卵泡发育、排卵、受精和蛋形成等生殖生理具有重要的作用[7]。当病原微生物侵入家禽生殖系统时，家禽首先会启动机体的非特异性免疫系统。其中TLRs 是宿主防御的天然免疫调节中心，同时又是天然免疫系统和获得性免疫系统的桥梁。当病原进入机体后，首先被TLRs 识别活化核转录因子，诱导机体产生细胞因子、趋化因子并诱导合成β- 防御素等，进而触发胞内直接杀菌机制或通过诱导炎症反应的发生，对侵入机体的病原微生物进行消灭或清除。

2.1 TLRs 在鸡生殖道中表达 尽管对脊椎动物体内TLRs 的表达和功能已经得到广泛地研究，但对鸡体内TLRs 的研究还只是停留在其在肠道中对病原菌的作用，有关TLRs 在生殖道中的表达及功能还未见相关研究报道。但禽类生殖系统存在对脂多糖(LPS)和其它病原微生物诱导TLRs 介导的免疫应答机制[8]。TLRs1-2、TLRs2-1、TLRs 2-2、TLRs 3、TLRs 4、TLRs 5、TLRs 7、TLRs 15 和TLRs21 可表达于鸡的阴道中[9-10]。整个输卵管中均存在TLRs1-2、TLRs2-1、TLRs2-2、TLRs3、TLRs4、TLRs5 和TLRs 7 的表达，其中在子宫和阴道其表达量最高[3]。Michailidis 等同时也证明当鸡感染沙门氏菌后卵巢中TLR4 和TLR15 含量均会增多[9]。尽管鸡的阴道免疫很重要，但鸡阴道中的TLRs 家族的表达情况及鸡感染SE 后TLRs 的表达变化之前却未见相应的研究报道。近几年有人用LPS 刺激鸡后发现在其输卵管和阴道TLR4 含量会增加[3,10]。表明TLRs 在宿主天然免疫防御中起着至关重要作用[3]。当性成熟的鸡和体成熟的鸡通过灌胃法注入SE后，检测到阴道中TLR3 mRNA 的含量并没有明显的增加[10]，这可能是因为TLR3 所识别的配体是dsRNA 有关，而对别的细菌感染不敏感。但是发现性成熟的鸡在感染SE后，阴道中的TLR5 和TLR15 含量会明显增加，TLR7 表达会明显减少，体成熟鸡阴道中TLR2-1、TLR4 和TLR15的表达量明显增多[10]。静脉注射SE 后，阴道中IL-1β 表达量增加[3]。在正常情况下，鸡体内其它组织器官内也会有TLRs 的表达，但其在不同品种鸡的相同组织中表达量不同的原因可能与鸡所遇到的应激情况或与病原接触后，机体的抵抗能力有关。

2.2 β- 防御素在鸡生殖道中的表达 β- 防御素是禽类重要的免疫调节因子，具有抵抗多种病原微生物包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和酵母等[11]感染功能，Evans 等通过体外抗菌活性实验证明了鸡体内的β-防御素能够杀死SE、空肠弯曲杆菌和白色念球菌[12]。目前已经在家禽生殖系统中发现了多个AvβDs 成员。其基因的表达分为固有表达(Constitutive expression)和诱导表达(Inducible expression)。一般认为固有表达的防御素在天然免疫系统中起重要作用。然而在感染等导致的全身性炎症反应中，诱导表达的β- 防御素比固有表达的防御素起更为重要的作用。AvβD4、AvβD7、AvβD9 表达于卵巢和输卵管可以抵抗沙门氏菌感染[13]。AvβD3、AvβD11、AvβD12在鸡的生殖道中表达，对鸡接种LPS 后，其表达量增加[14]。抗菌肽具有抗菌活性可以抵抗细菌感染并被认为有助于其它多肽对胚胎的免疫保护。抗菌肽在输卵管的膨大部和壳腺部得到表达，因此其可以进入鸡蛋中[15]，对鸡蛋也起到保护作用。Sadeyen 等对有沙门氏菌抗性的鸡群和对沙门氏菌易感鸡群接种沙门氏菌后观察防御素的表达情况，发现非易感鸡体内防御素表达高于易感鸡，而易感鸡感染沙门氏菌后，随时间推移β- 防御素表达呈逐渐上升趋势[16]。对鸡口服沙门氏菌后会发现其卵巢AvβD 4、AvβD 5、AvβD 7、AvβD 11、AvβD 12 基因表达增加， 但会下调AvβD 14 基因表达[17]。对鸡静脉注射LPS 后，发现其子宫里AvβD 3 和AvβD 11 表达增加[18]，而阴道中AvβD3、AvβD 5、AvβD 10、AvβD 11 和AvβD 12 表达也会增多[14]。这些防御素的表达将有利于生殖系统抵抗病原微生物的入侵从而维持生殖系统正常的生殖生理等功能。值得注意的是TLRs 和家禽β- 防御素的表达主要是在鸡的下级输卵管中，因此推测这可能是为了更有效地抵抗泄殖腔内病原微生物的感染。

3 鸡生殖道对沙门氏菌感染产生的获得性免疫应答

当病原微生物突破机体天然免疫屏障后，机体就会启动获得性免疫系统对细菌、病毒等微生物进行抵抗而发挥作用，产生免疫球蛋白或者使免疫细胞增殖，细胞因子表达水平发生变化等情况。鸡生殖道感染沙门氏菌后，会引起其生殖道局部免疫应答和全身性免疫应答。

3.1 沙门氏菌诱发的生殖道内局部免疫应答 粘膜表面是病原微生物入侵的主要部位，肠炎沙门氏菌在肠中的最初入侵部位是通过粘膜上皮细胞并进一步对内脏器官如脾脏，肝脏，卵巢和输卵管进行感染[19]，局部体液免疫应答在抵抗病原微生物定植方面起着很重要作用。有人证明对雌性动物生殖道进行免疫后，阴道局部SIgA 抗体水平会显著升高[20]。Withanage 证明蛋鸡感染沙门氏菌后，输卵管内抗体含量会增多，且在接种后第14 d IgG 和IgM 抗体水平达到峰值[21]。各种动物生殖道对病原微生物的处理不能只依靠体液免疫应答。Barua 等对鸡腹腔注射肠炎沙门氏菌后，利用免疫组织化学技术对卵巢基质和卵泡膜中CD3+、 CD4+和CD8+T 淋巴细胞进行定位和定量分析，发现接种SE 12 h 后淋巴细胞亚群数量增加，且接种后的24 h 比12 h 数量会进一步增多，但CD4+/CD8+没有变化，这种比率的平衡对于鸡抵抗SE 感染卵巢至关重要[22]。Withanage 等证明对鸡静脉注射SE 7 d 后，卵巢和输卵管中T 淋巴细胞均会增加并在第10 d 数量达到高峰，而B淋巴细胞在感染后第14 d 达到高峰，两者均是在21 d 恢复到感染前水平[23]。McSorley 等也发现鸡感染ST 3 h 后，CD4+T 细胞数量会显著增多[24]。鸡接种LPS 后，卵泡和基质中促炎细胞因子IL-6 和IL-1β 及趋化因子CXCL12 表达量也会增加[25]。另外在卵泡基质中的CD4+T 淋巴细胞和异嗜粒细胞含量也会增多，只是这种现象是暂时的。在这些研究中，抗体和淋巴细胞数量的增加与机体对细菌的清除同时发生。

3.2 沙门氏菌诱发的全身性免疫应答 Withanage 证明鸡感染SE 后第14 d，血清中IgG 和IgM 抗体水平达到最大值且鸡在整个产蛋期间血清中IgG 抗体水平一直维持较高水平[21]。对鸡接种SE 的鞭毛第4 d、7 d、11 d 和14 d后，血清中一氧化氮(NO)含量较高，它作为清除病原的效应分子有利于机体清除沙门氏菌，但血清中IFN-γ、IL-1、IL-6 只有在接种后第7 d 出现较高含量[26]。IFN-γ 作为Th1 类辅助T 淋巴细胞产生的因子，在粘膜(呼吸道和消化道)免疫反应中起着重要的作用，因为其表达量在各个时期明显高于其他细胞因子含量。近期研究发现鸡感染ST 的LPS 后IL-1 和IFN-γ mRNA 表达量均增多[27]，然而当鸡口服ST 后，其血液，盲肠，脾脏中CD8+T 细胞数量明显增多[28]。家禽感染沙门氏菌的方式是多样的，可以经过生殖道、口服和腹腔等感染，但其引起的免疫反应是局部免疫或全身免疫反应。有研究表明，家禽口服感染SE 两周后脾脏中IFN-γ，IL-12 和IL-18 的表达水平达最大值，ST 感染的情况与之相同，性成熟的禽类感染ST 后3 周，抗原特异性T 细胞增殖达到高峰[29]。SE 和ST 感染的生物学原理及对两种病原体的免疫反应非常相似。然而，目前还不清楚反应的哪种元素可以保护机体不受随后的感染。但是细胞介导的免疫反应可能是很重要的，在英国用灭活菌苗控制蛋鸡SE 病的成功初步表明，抗体在保护机体免受二次感染中发挥了重要作用。

4 结 语

雏鸡出壳后，其生殖道末端就直接与外界环境相接触，在这种情况下环境中和泄殖腔处病原菌就很有可能进入没有免疫保护作用的生殖道，使雏鸡在生长发育过程中一直处于携带病原状态或者死亡，哺乳动物不同于家禽，哺乳动物可以通过母乳持续供给获得母源抗体，而雏鸡只能一次性获得母源抗体，因此研究鸡生殖道粘膜免疫对于疫苗的研发很重要。鸡生殖道粘膜作为机体粘膜组成成分之一，在抵抗病原微生物侵害方面起重要作用。近些年有关鸡生殖道免疫系统结构及其组成成分的研究越来越多，可以通过免疫组织化学技术对免疫细胞类型进行检测，但是对这些细胞免疫功能的研究却相对较少，生殖道免疫组织在机体的整个免疫系统或局部免疫系统中的作用也不是十分清楚，生殖道局部感染是否可以诱导全身性免疫应答或全身性感染是否可以引起生殖道产生获得性免疫反应也值得进一步研究。疫苗在家禽养殖中得到了广泛的应用，但是对家禽接种沙门氏菌疫苗后产生的局部免疫应答情况还不清楚，只知道它可以引起促炎反应，而且大部分研究几乎都集中在疫苗引起机体产生的全身性免疫保护和应答上。总之，这些研究均较为片面，SE 和ST 作为人畜共患性沙门氏菌对人类健康造成极大的威胁，因此对鸡生殖道感染沙门氏菌后生殖道免疫情况进行研究有利于人类健康和禽类养殖，同时为预防鸡生殖道疾病提供了理论依据和参考，也为疫苗接种途径和免疫时间提供参考。