猫儿屎DS37菌株次生代谢产物化学成分的研究

王宁宁， 杨秀芳， 马养民

（陕西科技大学，陕西省轻化工助剂重点实验室，陕西西安710021）

猫儿屎 Decaisnea insignis（Griff.） Hook.f.＆Thomson系木通科猫儿屎属植物。是我国传统的民间中草药，别名猫屎瓜、矮杞树等，为丛生落叶直立灌木［1］，茎有圆形或椭圆形的皮孔，枝粗而脆，易断，广泛分布于我国西南部和中部地区。猫儿屎味辛、甘、性平，据 《陕西中草药》记载其根及果实具有清热解毒、滋润去燥、抗肿瘤［2］等功效。迄今为止，对猫儿屎的研究主要集中在植物化学成分，而对其内生真菌的研究较少［3］。内生真菌次生代谢产物种类主要有生物碱类［4］、 萜类［5］、 甾体［6］、 有机酸类［7］等。 为进一步开发猫儿屎植物的药用成分，本实验对从猫儿屎茎部分离得到的DS37菌株的次生代谢产物进行了研究，从中分离得到10个化合物，其中化合物3～9为首次从该发酵物中分离得到。

1 仪器与材料

1.1 仪器 核磁共振光谱用Bruker avanceⅢ-400 MHz核磁共振仪测定 （TMS内标）、ESI-MS谱用Bruker micrOTOF-QⅡ 型质谱仪测定 （瑞士Bruker公司）；R502B旋转蒸发仪 （上海市申生科技有限公司）；XT-5显微熔点测定仪 （北京科仪光电仪器厂）；ZHJH-C1109B型超净工作台 （上海智城分析仪器制造有限公司）；YX280B手提式不锈钢压力蒸汽灭菌锅 （江苏江阴市滨江医疗设备厂）；HZQQ空气恒温振荡器 （哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；DH5000B恒温培养箱 （天津泰斯特仪器有限公司）。

1.2 试剂 柱层析色谱硅胶 （200～300目）、柱色谱凝胶和薄层层析硅胶G（青岛海浪硅胶干燥剂厂）。石油醚、乙酸乙酯、甲醇 （天津市红岩试剂厂）；氘代氯仿 CDCl3、氘代 DMSO （ARMAR Chemicals）。所用试剂均为分析纯。

1.3 药材 猫儿屎采自陕西秦岭山区，经本课题组王鹏飞等［3］从其茎部分离得到内生真菌DS37。通过对其形态学观察结合ITS序列分析构建系统发育树，最终鉴定该菌株为Aspergillus tubingensis（Genbank序列号为MG495096），保藏在中国典型培养物保藏中心 （保藏编号为 CCTCC M 2018147）。

2 提取与分离

菌株DS37经过活化后，从斜面接种到装有400 mL察氏培养基的1 000 mL锥形瓶中，在28℃，180 r／min下振荡培养7 d制备成种子培养液。将装好大米培养基的发酵瓶置于手提式不锈钢压力蒸汽灭菌锅内灭菌20 min，然后按照10%的接种量将种子培养液接种于上述大米培养基中，共计接种300瓶，在室温下静置培养35 d。

猫儿屎内生真菌固体发酵物 （9.2 kg）用石油醚-乙酸乙酯-甲醇浸提8次，合并提取液并过滤，回收混合溶剂，减压浓缩，得到粗品浸膏1 500 g。粗品浸膏在硅胶色谱柱上，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇 （1∶0∶0、 0∶1∶0、0∶1∶1、 0∶0∶1） 洗脱，得4个组分 Fr.A （110 g）、 Fr.B （420 g）、Fr.C （700 g）、 Fr.D （100 g）。 取 Fr.B 组分200 g与硅胶1∶1拌样，经硅胶柱，以石油醚-乙酸乙酯（100 ∶0、 100 ∶20、 100 ∶50、 100 ∶100、 100 ∶200、0∶100） 和乙酸乙酯-甲醇 （100 ∶20、 100 ∶50、100∶100、0∶100）洗脱，得10个组分 Fr.B1-Fr.B10。Fr.B4再经硅胶柱，以石油醚-乙酸乙酯（100∶0、 100 ∶25、 100 ∶50、 100 ∶70、 100 ∶90、100 ∶100、 100 ∶130、 100 ∶150、 100 ∶180、100∶200、0∶100）洗脱，重结晶得化合物 1（1.2 g）、 2 （2.1 g）、 7 （3.5 g）、 9 （17.3 mg）、10（6.1 mg）；Fr.B5经硅胶柱和重结晶得化合物5 （72.4 mg）、 6 （120.8 mg）、 8 （106.2 mg）；Fr.B6经硅胶柱，以石油醚-乙酸乙酯 （100∶0、100∶10、 100∶20、 100∶25、 100 ∶30、 100 ∶50、100∶100、100∶200、0∶100） 洗脱，得9个组分Fr.B6.1-Fr.B6.9，Fr.B6.8经Sephadex LH-20柱分离纯化，得化合物3（4.2 mg）、4（7.6 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：白色晶体（甲醇），ESI-HR-MS m／z：273.074 5 ［M＋H］＋， 分子式为 C15H12O5， mp 277～ 278 ℃。1H-NMR （400 MHz， DMSO-d6）： δ 7.18 （1H，d，J＝1.8 Hz，H-6），6.71 （1H， d， J＝1.8 Hz， H-5′）， 6.63 （1H， d， J＝ 2.4 Hz， H-3′），6.59 （1H， d， J＝1.8 Hz， H-4）， 3.90 （3H， s， H-8）， 2.71 （2H， s， H-7′）；13C-NMR （100 MHz，DMSO-d6）： δ 165.93 （C-5）， 164.52 （C-7），164.00 （C-3）， 158.43 （C-4′）， 152.47 （C-2′），138.17 （C-6′）， 137.57 （C-1）， 117.47 （C-5′），108.62 （C-1′）， 103.07 （C-6）， 101.52 （C-3′），98.91 （C-4）， 98.26 （C-2）， 55.62 （C-8）， 24.89（C-7′）。以上数据与文献 ［8］基本一致，故鉴定为交链孢酚甲醚。

化合物2：白色粉末（甲醇），ESI-HR-MS m／z：259.059 9 ［M＋H］＋， 分子式为 C14H10O5， mp 264～ 266 ℃。1H-NMR （400 MHz， DMSO-d6）： δ 7.24 （1H， s， H-6）， 6.71 （1H， s， H-5′）， 6.63（1H， s， H-3′）， 6.37 （1H， s， H-4）， 2.70 （3H， s，H-7′）；13C-NMR （100 MHz， DMSO-d6）： δ 165.33（C-5）， 164.63 （C-7）， 164.02 （C-3）， 158.34 （C-4′）， 152.56 （C-2′）， 138.23 （C-6′）， 138.05 （C-1）， 117.46 （C-5′）， 108.92 （C-1′）， 104.24 （C-6）， 101.54 （C-3′）， 100.80 （C-4）， 97.35 （C-2），25.15（C-7′）。 以上数据与文献［9］基本一致， 故鉴定为交链孢酚。

化合物3：红色针晶（甲醇），ESI-HR-MS m／z：209.081 4 ［M＋H］＋， 分子式为 C11H10O4， mp 189～ 191 ℃。1H-NMR （400 MHz， DMSO-d6）： δ 10.28 （1H， s， 7-OH）， 6.73 （1H， d， J＝7.8 Hz，H-6）， 5.58 （1H， d， J＝7.8 Hz， H-8）， 4.16 （1H，s， H-3）， 3.95 （3H， s， 4-OMe）， 2.60 （3H， s， 5-Me）；13C-NMR （100 MHz， DMSO-d6）： δ 169.68（C-2）， 161.75 （C-7）， 158.50 （C-4）， 153.93 （C-9），137.09 （C-5），115.56 （C-6），106.08 （C-10），105.70 （C-8）， 86.46 （C-3）， 56.55 （4-OMe），23.21（5-Me）。以上数据与文献 ［10］基本一致，故鉴定为7-羟基-4-甲氧基-5-甲基香豆素。

化合物4：棕色粉末（甲醇），ESI-HR-MS m／z：439.137 6 ［M＋H］＋， 分子式为C24H22O8， mp 297～298 ℃。1H-NMR （400 MHz， DMSO-d6）： δ 7.02（2H， s， H-6， H-6′）， 5.65 （2H， s， H-3， H-3′），3.97 （6H， s， 4-OMe， 4′-OMe）， 3.76 （6H， s， 7-OMe， 7′-OMe）， 2.71 （6H， s， 5-Me， 5′-Me）；13CNMR （100 MHz， DMSO-d6）： δ 169.35 （C-4， C-4′）， 161.40 （ C-2， C-2′）， 159.16 （ C-7， C-7′），152.80 （C-9， C-9′）， 138.28 （C-5， C-5′）， 111.56（C-6， C-6′）， 107.58 （C-8， C-8′）， 106.74 （C-10，C-10′）， 87.38 （C-3， C-3′）， 56.72 （4-OMe， 4′-OMe）， 56.11 （7-OMe， 7′-OMe）， 23.44 （5-Me， 5′-Me）。以上数据与文献 ［11］基本一致，故鉴定为5， 5′-二甲基-4， 4′， 7， 7′-四甲氧基-8， 8′-双香豆素。

化合物5：棕色粉末（甲醇），ESI-HR-MS m／z：425.122 0 ［M＋H］＋， 分子式为 C23H20O8， mp 305～307 ℃。1H-NMR （400 MHz， DMSO-d6）： δ 10.20（s， 7-OH）， 7.02 （1H， s， H-6′）， 6.73 （1H， s， H-8）， 5.64 （1H， s， H-3）， 5.58 （1H， s， H-3′），3.97 （3H， s， 4′-OMe）， 3.95 （3H， s， 4-OMe），3.76 （3H， s， 7′-OMe）， 2.72 （3H， s， 5′-Me），2.60 （3H， s， 5-Me）；13C-NMR （100 MHz， DMSO-d6）： δ 169.66 （C-4）， 169.35 （C-4′）， 161.72 （C-2′）， 161.37 （C-2）， 159.18 （C-7′）， 158.47 （C-7）， 153.95 （C-9）， 152.81 （C-9′）， 138.26 （C-5′）， 137.07 （C-5）， 115.56 （C-6）， 111.57 （C-8′）， 107.59 （C-6′）， 106.78 （C-10′）， 106.16 （C-10）， 105.71 （C-8）， 87.39 （C-3）， 86.49 （C-3′），56.71 （4′-OMe）， 56.54 （4-OMe）， 56.11 （7′-OMe）， 23.43 （5′-Me）， 23.19 （5-Me）。 以上数据与文献 ［12］基本一致，故鉴定为5，5′-二甲基-7-羟基-4， 4′， 7′-三甲氧基-6， 8′-双香豆素。

化合物6：无色晶体（甲醇），ESI-HR-MS m／z：200.056 1 ［M-H］－， 分子式为 C8H11NO5， mp 214～ 216 ℃。1H-NMR （400 MHz， DMSO-d6）： δ 10.03 （1H， s， NH），7.45 （1H， d， J＝3.2 Hz， H-3）， 5.17 （1H， dd， J＝9.8， 3.0 Hz， H-4）， 4.83（1H， m， H-5）， 3.70 （1H， dd， J＝11.0， 6.0 Hz，H-6a）， 3.46 （1H， dd， J＝11.0， 6.6 Hz， H-6b），2.07 （3H， s， 8-Me）；13C-NMR （100 MHz， DMSO-d6）： δ 169.58 （C-1）， 169.02 （C-7）， 127.50 （C-2）， 126.50 （C-3）， 81.51 （C-4）， 71.41 （C-5），62.62（C-6）， 22.95 （C-8）。 以上数据与文献［13］基本一致，故鉴定为leptosphaepin。

化合物7：黄色油状 （石油醚）。1H-NMR（400 MHz， CDCl3）： δ 5.35 （4H， m， H-9″， H-10″， H-12″， H-13″）， 5.26 （1H， m， H-2）， 4.32 （2H， dd，J＝14.2 Hz， H-1b， H-3b）， 4.18 （2H， dd， J＝14.2 Hz， H-1a， H-3a）， 2.78 （2H， m， H-11″）， 2.33（4H， t， J＝7.8 Hz， H-2′， H-2‴）， 2.31 （2H， t， J＝7.8 Hz， H-2″）， 2.05 （4H， m， H-8″， H-14″）， 1.62（6H， m， H-3′， H-3″， H-3‴）， 1.31 （28H， m， H-4′， H-5′， H-6′， H-7′， H-4″， H-5″， H-7″， H-15″， H-16″， H-17″， H-4‴， H-5‴， H-6‴， H-7‴）， 0.89 （9H，bt， H-8′， H-8‴， H-18″）；13C-NMR （ 100 MHz，CDCl3）： δ 172.83 （C-1″）， 172.79 （C-1′）， 172.38（C-1‴）， 129.70 （C-13″）， 129.50 （C-12″）， 127.56（C-10″）， 127.39 （C-9″）， 68.39 （C-2）， 61.61 （C-1b），61.61 （C-3b），61.61 （C-1a），61.61 （C-3a），33.69 （ C-2″）， 33.55 （ C-2′）， 33.52 （ C-2‴），31.44 （ C-16″）， 31.42 （ C-6′）， 31.03 （ C-6‴），29.28 （C-7‴）， 29.22 （C-5‴）， 29.04 （C-4‴），28.84 （ C-17″）， 28.69 （ C-15″）， 28.63 （ C-7″），28.59 （ C-5″）， 28.55 （ C-8″）， 26.70 （ C-14″），26.68 （ C-3′）， 25.13 （ C-3″）， 24.37 （ C-11″），24.34 （ C-3‴）， 24.19 （ C-4″）， 22.20 （ C-7′），22.20 （C-5′）， 22.09 （C-4′）， 13.62 （C-8′）， 13.62（C-8‴）， 13.58 （C-18″）。 以上数据与文献 ［14］基本一致，故鉴定为1，3-二辛酰基-2-亚油酸甘油酯。

化合物 8：白色粉末 （甲醇），mp 294～295 ℃。1H-NMR （400 MHz， DMSO-d6）： δ 5.34（1H，m，H-6）， 4.89 （1H， m， H-1′）， 4.43 （2H，t， J＝11.6 Hz， H-6′）， 4.21 （1H， d， J＝7.8 Hz， H-4′），3.65 （1H， m， H-3）， 0.96 （3H， m， H-21），0.91（3H，m，H-19），0.90（3H，d，J＝6.4 Hz，H-4′），0.83 （3H， m， H-29）， 0.81 （3H， m， H-27），0.66 （3H， s， H-18）；13C-NMR （100 MHz， DMSO-d6）： δ 140.43 （C-5）， 121.30 （C-6）， 100.63 （C-1′）， 76.90 （C-3）， 76.72 （C-3′）， 73.42 （C-2′），70.09 （ C-4′）， 61.04 （ C-6′）， 56.14 （ C-14），55.39 （C-17），49.51 （C-9），45.10 （C-24），41.90（C-13）， 40.10 （C-12）， 38.27 （C-4）， 36.80 （C-20）， 36.18 （C-1）， 35.50 （C-10）， 33.30 （C-22），31.32 （C-7）， 29.30 （C-2）， 28.65 （C-25）， 27.77（C-16），25.37 （C-23），23.83 （C-15）， 22.56 （C-28），20.52 （C-11），19.69 （C-26），19.07 （C-19），18.86 （C-21）， 18.54 （C-27）， 11.75 （C-18），11.64（C-29）。以上数据与文献 ［15］基本一致，故鉴定为胡萝卜苷。

化合物9：橘色晶体（甲醇），ESI-HR-MS m／z：571.159 7 ［M＋H］＋， 分子式为 C32H26O10， mp 292～294 ℃。1H-NMR （400 MHz， CDCl3）： δ 15.25（1H， s， 5-OH）， 12.84 （1H， s， 5′-OH）， 7.06（1H， s， H-9）， 6.99 （1H， s， H-10）， 6.45 （1H，d， J＝2.2 Hz， H-9′）， 6.35 （1H， s，， H-3′）， 6.21（1H， d， J＝ 2.2 Hz， H-7′）， 6.02 （1H， s， H-3），4.04 （3H， s， 10′-OMe）， 3.80 （3H， s， 6-OMe），3.63 （3H， s， 8′-OMe）， 3.45 （3H， s， 8-OMe），2.50 （3H， s， 2-Me）， 2.14 （3H， s， 2′-Me）；13CNMR （100 MHz， CDCl3）： δ 184.06 （C-4）， 182.43（C-4′）， 167.00 （C-2）， 166.38 （C-2′）， 162.31（C-5）， 161.11 （C-8′）， 160.64 （C-10′）， 159.55（C-6）， 156.44 （C-5′）， 156.18 （C-8）， 154.61 （C-10b′）， 150.35 （C-10a）， 140.31 （C-6a′）， 140.16（C-9a）， 116.65 （C-7）， 110.14 （C-5a）， 108.90（C-3′）， 108.13 （C-4a′）， 107.51 （C-3）， 106.85（C-6′）， 105.54 （C-9）， 104.56 （C-10a′）， 103.75（C-4a）， 101.08 （C-10）， 96.52 （C-9′）， 95.88 （C-7′）， 60.71 （5′-OH）， 55.72 （8-OMe）， 55.48 （10′-OMe）， 54.68 （8′-OMe）， 20.16 （2-Me）， 20.03（2′-Me）。以上数据与文献 ［16］ 基本一致，故鉴定为asperpyrone C。

化合物 10：橘色晶体 （甲醇），ESI-HR-MS m／z： 557.142 2 ［M＋H］＋， 分子式为 C31H24O10，mp 268～270 ℃。1H-NMR （400 MHz， DMSO-d6）： δ 15.12 （1H， s， 5-OH）， 12.98 （1H， s， 5′-OH），10.24 （1H， s， 8-OH）， 7.34 （1H， s， H-9）， 7.15（1H， s， H-10）， 6.55 （1H， d， J＝2.2 Hz， H-9′），6.52 （1H， s， H-3′）， 6.22 （1H， d， J＝2.2 Hz， H-7′）， 6.09 （1H， s， H-3）， 3.93 （3H， s， 10′-OMe），3.76 （3H， s， 6-OMe）， 3.58 （3H， s， 8′-OMe），2.48 （3H， s， 2-Me）， 2.13 （3H， s， 2′-Me）；13CNMR （100 MHz， DMSO-d6）： δ 183.90 （C-4），182.45 （C-4′）， 168.52 （C-2）， 168.25 （C-2′），162.07 （C-5）， 161.24 （C-8′）， 160.80 （C-10′），159.53 （C-6）， 156.28 （C-5′）， 155.89 （C-8），154.48 （C-10b′）， 150.12 （C-10a）， 140.34 （C-6a′）， 139.97 （C-9a）， 116.41 （C-7）， 110.05 （C-5a）， 108.52 （C-3′）， 107.54 （C-4a′）， 107.32 （C-3）， 106.78 （C-6′）， 105.45 （C-9）， 104.85 （C-10a′）， 103.24 （C-4a）， 102.06 （C-10）， 96.54 （C-9′）， 96.52 （C-7′）， 61.05 （5′-OH）， 56.08 （10′-OMe）， 55.05 （8′-OMe）， 20.11 （2-Me）， 19.91（2′-Me）。以上数据与文献 ［17］ 基本一致，故鉴定为asperpyrone D。

4 结论

通过对猫儿屎内生真菌DS37发酵物进行提取分离，从中得到10个化合物，其中化合物3～9为首次从该发酵物中分离得到。本实验发现该菌株发酵物中不仅含有目前报道的生物碱类、甾体类、有机酸类等化合物，还含有香豆素类化合物。本研究丰富了猫儿屎内生真菌代谢产物的化学成分，以期为天然产物的开发提供参考。