虎掌南星化学成分及其抑菌活性

2019-01-10张慧茹曹美娇单国顺刘晓月

中成药 2019年4期

潘多，张慧茹，曹美娇，单国顺，刘晓月，高慧，许枬

（辽宁中药大学药学院，辽宁大连 116600）

天南星应用历史悠久，为常用中药，其性温，味苦、辛，有毒，具燥湿化痰、祛风定惊、消肿散结之功效，用于治疗顽痰咳嗽、风疾眩晕、中风、口眼歪斜、半身不遂、癫痫、惊风、破伤风等疾病[1］，近年来研究发现它有良好的抗宫颈癌、抗氧化、止咳等作用[2］。但由于历代本草记载的不一致，加之同科属植物在形态上相似及各地民间用药习惯不同，导致该药材来源十分混乱[2］。目前《中国药典》收载的天南星是天南星属植物，但唐代以前本草著作中记载的都是半夏属植物虎掌南星，也称掌叶半夏Pinellia pedatisecta Schott，首载于我国现存最早的本草著作《神农本草经》中，列为下品[3］；天南星之名始见于唐代《图经本草》[4］，《开宝本草》《证类本草》中天南星和虎掌之名同用[5-6］，因此，有很多学者提出将虎掌南星作为天南星的来源之一，或在药典中增加其条目。据市场调查，目前国内的栽培品种和商品天南星的主流均为虎掌南星[2，7］，课题组调查发现很多厂家生产胆南星时也使用虎掌南星作为原料。为更好地揭示天南星的物质基础，确保其临床疗效，本实验对虎掌南星的化学成分及其活性进行研究，从中分离得到10 个化合物，均首次从该植物中分离得到，而且4、 7 有较强的抗菌活性。

1 材料

Bruker AVANCE-600 超导核磁共振仪（德国布鲁克公司）； Agilent Technologies 6490 质谱仪（美国Agilent 公司）； Finnigan VoyagerGC／MS 联用仪（美国菲尼根质谱公司）； Sephadex LH-20 凝胶（瑞士法玛西亚公司）； CHP 20P 型MCI 凝胶（日本三菱公司）；柱色谱用硅胶（100 ～200 目，青岛海洋化工有限公司）； ODS-C18（50 μm，日本富士化学有限公司）； TLC 薄层板（德国默克公司）。所用试剂均为分析纯（天津科密欧试剂有限公司）；色谱纯甲醇（美国天地公司）；纯净水（娃哈哈集团有限公司）；氘代试剂（北京恒思公司）；显色剂为5%香草醛-浓硫酸溶液（自制）。虎掌南星购于河北安国药材市场，经辽宁中医药大学贾天柱教授鉴定为正品。

2 提取与分离

取虎掌南星10 kg，加乙醇浸泡提取2 周，收集提取液，减压回收溶剂， 460 g 浸膏加水混悬，氯仿萃取，减压回收溶剂，得氯仿萃取物235 g 及剩余水层。抑菌实验显示，虎掌南星的氯仿萃取物有明确的抑菌作用，故取230 g 经硅胶柱，以石油醚-乙酸乙酯（100 ∶0、 50 ∶1、 25 ∶1、 10 ∶1、5 ∶1）梯度洗脱，经硅胶薄层检识，合并相同斑点的流份，得6 个组分（Ⅰ～Ⅵ）。其中组分Ⅱ（12.3 g）经硅胶柱，以环己烷-乙酸乙酯（80 ∶20）洗脱，得化合物1 （40.5 mg）；组分Ⅱ（55.2 g）反复经硅胶柱及ODS 柱，得化合物2 （20.0 mg）、 3 （15.0 mg）；组分Ⅲ（43.4 g）经MCI 柱、ODS 柱纯化后，再经 HPLC，以甲醇-水溶液（90 ∶10）洗脱，得化合物4 （21.2 mg）、 5 （11.6 mg）、 6 （12.9 mg）、 7 （18.5 mg）、 8 （18.2 mg）、 9 （19.0 mg）；组分V （40.7 g）经MCI 柱纯化后，再经ODS 柱，以甲醇-水（72 ∶38）洗脱，得化合物10 （40.5 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：无色粉末。 Liebermann-Burchard 反应为污绿色，提示其为甾体类化合物。采用TLC分析，以3 种色谱系统检识，经与β-谷甾醇对照发现Rf值相同，故鉴定为β-谷甾醇。

化合物2：无色粉末。 ESI-MS m／z： 279 [M＋H］＋。1H-NMR （600 MHz， CDOD3） δ： 7.71 （2H，m， H-3， 4）， 7.60 （2H， m， H-2， 5）， 4.29 （4H，t， J=6.6 Hz， H-1′）， 1.71 （4H， p， J=7.3， 6.6 Hz， H-2′）， 1.45 （4H， h， J = 7.3， 6.6 Hz， H-3′）， 0.95 （6H， t， J = 7.3 Hz， H-4′）；13C-NMR（150 MHz， CDOD3） δ： 12.6 （C-4′）， 18.8 （C-3′）， 30.3 （C-2′）， 65.2 （C-1′）， 128.5 （C-3，4）， 130.9 （C-2， 5）， 132.2 （C-1， C-6）， 167.9（-COO）。以上数据与文献[8］基本一致，故鉴定为邻苯二甲酸二丁酯。

化合物3：无色粉末。 Liebermann-Burchard 反应为污绿色， Molish 反应阳性，提示其为甾体苷类化合物。采用TLC 分析，以3 种色谱系统检识，经与胡萝卜苷对照品比对发现Rf值相同，故鉴定为胡萝卜苷。

化合物4：无色粉末。 ESI-MS m／z： 755 [M＋H］＋。1D-NMR 谱数据显示结构中有1 个糖和长碳链片段，提示其为糖脂类化合物[9］。1H-NMR 谱中，观察到δ 4.78 （1H， d， J=7.7 Hz）， 4.53 （1H，d， J=3.0 Hz）， 4.41 （2H， m）， 4.11 （1H， dd，J=3.0， 9.4 Hz）， 4.03 （1H， m）质子；13C-NMR中观察到 δ 105.7， 77.1， 75.2， 72.2， 70.0，62.0 的碳信号及1H-NMR 中糖质子的J1 ‘2’ =7.7 Hz （diaxial）和J3 ‘4’ =3.0 Hz （axial-equatorial），表明4 中的糖基为β-D-吡喃半乳糖基[9］。由1H-NMR 谱中观察到1 个ABMXY 自旋系统δ 5.64 （1H， m）， 4.66 （1H， dd， J = 3.0， 11.9 Hz）， 4.49 （1H， dd， J = 5.3， 11.9 Hz）， 4.33（1H， dd， J = 5.3， 10.8 Hz）， 4.03 （2H， m），13C-NMR谱中观察到3 个连氧碳信号δ 71.0， 68.0，63.2，表明该化合物结构中有1 个甘油基。 2 个酰基的羰基碳信号分别出现在δ 1 753.7 和173.1，特征质子信号如δ 2.89 （2H， m）， 2.08 （4H，m）， 1.61 （4H， m）， 1.32 （4H， m）， 0.84 （6H，t， J=6.7 Hz）分别为邻接双键的亚甲基，邻接羰基的亚甲基以及末端甲基信号，双键的构型根据碳谱中邻接双键的亚甲基碳信号δ 27.5， 27.4 确定为顺式[9］。将1 用10% NaOMe-MeOH 碱水解，产物经GC-MS 分析证明酰基部分为十六烷酰基和亚油酰基，两者比为1 ∶1，综上所述，推定1 的结构为（2S） -1-O-十六碳酰基-2-O-亚油酰基- 3-O-β-D-吡喃半乳糖基甘油。1H-NMR （600 MHz， pyridined6） δ： 5.64 （1H， m， H-2）， 5.48 （4H， m， H-9′， 10′， 12′， 13′）， 4.78 （1H， d， J=7.7 Hz， H-1‴）， 4.66 （1H， dd， J = 3.0， 11.9 Hz， H-1a），4.53 （1H， brd， J = 3.3 Hz， H-4‴）， 4.49 （1H，dd， J=5.3， 11.9 Hz， H-1b）， 4.41 （3H， m， H-2‴， 6‴）， 4.33 （1H， dd， J = 5.3， 10.8 Hz， H-3a）， 4.11 （1H， dd， J = 3.3， 9.4 Hz， H-3‴），4.03 （2H， m， H-5‴， H-3b）， 2.89 （2H， m， H-11′）， 2.32 （4H， m， H-2′， 2″）， 2.08 （4H， m，H-8′，14′）， 1.61 （4H，m，H-3′，3″）， 1.32 （4H，m， H-15′， 13″）， 1.24 （34H， m， H-4′～7′， 16′，17′， 4″～12″， 14″， 15″）， 0.84 （6H， t， J=6.7 Hz，H-16″， 18′）；13C-NMR （150 MHz， pyridine-d6） δ：63.0 （C-1）， 68.0 （C-3）， 71.0 （C-2）， 174.0，173.7 （ C-1′， C-1″）， 34.4， 34.2 （ C-2′， 2″），25.2 （ C-3′， 3″）， 30.0， 29.9， 29.8， 29.6，29.5， 29.4， 29.3， 29.2 （C-4″～13″， 4′～7′， 15′），27.4， 27.5 （C-8′， 14′）， 130.4， 130.3， 128.7，128.3 （C-9′， C-10′， C-12′， C-13′）， 26.0 （C-11′）， 32.1， 31.6 （ C-16′， 14″）， 22.9， 22.8（C-17′， 15″）， 14.3， 14.2 （C-18′， 16″）， 105.7（C-1‴）， 72.2 （C-2‴）， 75.2 （C-3‴）， 70.0 （C-4‴）， 77.1 （C-5‴）， 62.0 （C-6‴）。以上数据与文献[10］基本一致，故鉴定为（2S） -1-O-十六碳酰基-2-O-亚油酰基-3-O- β-D-半乳糖基甘油。

化合物5：无色粉末状。 ESI-MS m／z： 753[M＋H］＋。1H-NMR （ 600 MHz， pyridine-d5） δ：5.65 （1H， m， H-2）， 5.48 （6H， m， H-6′， 7′，9′， 10′， 12′， 13′， 9″， 10″）， 4.78 （1H， d， J =7.7 Hz， H-1‴）， 4.66 （1H， dd， J=3.0， 11.9 Hz，H-1a）， 4.53 （1H， d， J = 3.3 Hz， H-4‴）， 4.49（1H， dd， J = 5.3， 11.9 Hz， H-1b）， 4.41 （3H，m， H-2‴， 6‴）， 4.33 （1H， dd， J=5.3， 10.8 Hz，H-3a）， 4.11 （1H， dd， J=3.3， 9.4 Hz， H-3‴），4.03 （2H， m， H-5‴， H-3b）， 2.89 （2H， m， H-11′）， 2.32 （4H， m， H-2′， 2″）， 2.08 （8H， m，H-8′， 14′， 8″， 11″）， 1.61 （4H， m， H-3′， 3″），1.32 （4H， m， H-15′， 13″）， 1.24 （32H， m， H-4″～7″， 4′ ～7′， 16′， 17′， 12″， 13″， 14″， 15″），0.84 （6H， t， J = 7.7 Hz， H-16′， 18″）；13C-NMR（150 MHz， pyridine-d5） δ： 63.0 （C-1）， 71.0（C-2）， 68.0 （C-3）， 174.0，173.7 （C-1′， C-1″），34.4， 34.2 （C-2′， 2″）， 25.2 （C-3′， 3″）， 30.0，29.9， 29.8， 29.6， 29.5， 29.4， 29.3， 29.2 （C-4″～7″， 12″， 13″， 4′～7′， 15′）， 27.4， 27.5 （C-8′， 14′）， 130.4， 130.3， 130.2， 130.1， 128.7，128.3 （ C-9′， C-10′， C-12′， C-13′， 9″， 10″），32.1， 31.6 （C-16′， 14″）， 22.9， 22.8 （C-17′，15″）， 14.3， 14.2 （C-18′， 16″）， 105.7 （C-1‴），72.2 （C-2‴）， 75.2 （C-3‴）， 70.0 （C-4‴）， 77.1（C-5‴）， 62.0 （C-6‴）。该化合物经碱水解及GCMS 分析证明酰基为亚油酰基和9Z-十六烷酰基，二者比例1 ∶1。以上数据与文献[11-12］基本一致，故鉴定为diacylgalactolipid Ⅰ。

化合物6：无色粉末状。 ESI-MS m／z： 783[M＋H］＋。1H-NMR （ 600 MHz， pyridine-d5） δ：5.65 （1H， m， H-2）， 5.48 （4H， m， H-6′， 7′，9′， 10′， 12′， 13′）， 4.78 （1H， d， J=7.7 Hz， H-1‴）， 4.66 （1H， dd， J = 3.0， 11.9 Hz， H-1a），4.53 （1H， d， J=3.3 Hz， H-4‴）， 4.49 （1H， dd，J= 5.3， 11.9 Hz， H-1b）， 4.41 （3H， m， H-2‴，6‴）， 4.33 （1H， dd， J = 5.3， 10.8 Hz， H-3a），4.11 （1H， dd， J = 3.3， 9.4 Hz， H-3‴）， 4.03（2H， m， H-5‴， H-3b）， 2.89 （2H， m， H-11′），2.32 （4H， m， H-2′， 2″）， 2.08 （4H， m， H-8′，14′）， 1.61 （4H， m， H-3′， 3″）， 1.32 （4H， m，H-15′， 15″）， 1.24 （42H， m， H-4″～15″， 4′～7′，16′， 16″， 17′， 17″）， 0.84 （6H，t，J=7.7 Hz，H-18′， 18″）；13C-NMR （150 MHz， pyridine-d5） δ：63.0 （C-1）， 71.0 （C-2）， 68.0 （C-3）， 174.0，173.7 （ C-1′， C-1″）， 34.4， 34.2 （ C-2′， 2″），25.2 （ C-3′， 3″）， 30.0， 29.9， 29.8， 29.6，29.5， 29.4， 29.3， 29.2 （C-4″～15″， 4′～7′， 15′），27.4， 27.5 （C-8′， 14′）， 130.4， 130.3， 128.7，128.3 （C-9′， C-10′， C-12′， C-13′）， 32.1， 31.6（C-16′， 16″）， 22.9， 22.8 （C-17′， 17″）， 14.3，14.2 （C-18′， 18″）， 105.7 （ C-1‴）， 72.2 （ C-2‴）， 75.2 （C-3‴）， 70.0 （C-4‴）， 77.1 （C-5‴），62.0 （C-6‴）。该化合物经碱水解及GC-MS 分析证明酰基为亚油酰基和十八烷酰基，二者比例1 ∶1。以上数据与文献 [10］基本一致，故鉴定为（2S） -1-O-十八碳酰基-2-O-亚油酰基-3-O-β-D-半乳糖基甘油。

化合物7：无色粉末状。 ESI-MS m／z： 779[M＋H］＋。1H-NMR （ 600 MHz， pyridine-d5） δ：5.63 （1H， m， H-2）， 5.47 （8H， m， H-9′， 9″，10′， 10″， 12′， 12″， 13′， 13″）， 4.79 （1H， d， J=7.7 Hz， H-1‴）， 4.66 （1H， dd， J=3.0， 11.9 Hz，H-1a）， 4.53 （1H， d， J = 3.3 Hz， H-4‴）， 4.49（1H， dd， J = 5.3， 11.9 Hz， H-1b）， 4.41 （3H，m， H-2‴， 6‴）， 4.33 （1H， dd， J=5.3， 10.8 Hz，H-3a）， 4.11 （1H， dd， J=3.3， 9.4 Hz， H-3‴），4.03 （2H， m， H-5‴， H-3b）， 2.89 （4H， m， H-11′， 11″）， 2.32 （4H， m， H-2′， 2″）， 2.08 （8H，m， H-8′，8″，14′，14″）， 1.61 （4H， m， H-3′，3″），1.32 （ 4H， m， H-13′， 13″， 15′， 15″）， 1.24（24H， m， H-4′～7′， 4″～7″， 16′， 16″， 17′， 17″），0.84 （6H， t， J = 7.7 Hz， H-18′， 18″）；13C-NMR（150 MHz， pyridine-d5） δ： 63.0 （C-1）， 71.0（C-2）， 68.0 （C-3）， 174.0，173.7 （C-1′， C-1″），34.4， 34.2 （C-2′， 2″）， 25.2 （C-3′， 3″）， 30.0，29.9， 29.8， 29.6， 29.5， 29.4， 29.3， 29.2 （C-4″～7″， 4′～7′， 15′， 15″）， 27.5， 27.4 （C-8′， 8″，14′， 14″）， 26.0 （C-11′， 11″）， 130.4， 130.3，128.7， 128.3， 127.4 （C-9′， 9″， 10′， 10″， 12′，12″， 13′， 13″）， 31.6 （C-16′， 16″）， 22.8 （C-17′， 17″）， 14.2 （C-18′， 18″）， 105.7 （C-1‴），72.2 （C-2‴）， 75.2 （C-3‴）， 70.0 （C-4‴）， 77.1（C-5‴）， 62.0 （C-6‴）。该化合物经碱水解及GCMS 分析证明酰基为亚油酰基。以上数据与文献[13-14］基本一致，故鉴定为（2S） -1， 2-双-亚油酰基-3-O-β-D-半乳糖基甘油。

化合物8：无色粉末状。 ESI-MS m／z： 703[M＋H］＋。1H-NMR （ 600 MHz， pyridine-d5） δ：5.65 （1H， m， H-2）， 4.82 （1H， d， J=7.7 Hz，H-1‴）， 4.67 （1H， dd， J=3.0， 11.9 Hz， H-1a），4.56 （1H， d， J=3.3 Hz， H-4‴）， 4.52 （1H， dd，J= 5.3， 11.9 Hz， H-1b）， 4.44 （3H， m， H-2‴，6‴）， 4.33 （1H， dd， J = 5.3， 10.8 Hz， H-3a），4.14 （1H， dd， J = 3.3， 9.4 Hz， H-3‴）， 4.07（2H， m， H-5‴， H-3b）， 2.31 （4H， m， H-2′， 2″），1.61 （4H， m， H-3′， 3″）， 1.32 （4H， m， H-15′，15″）， 1.21 （48H， m， H-4″～15″， 4′～15′）， 0.78（6H， t， J= 7.7 Hz， H-16′， 16″）；13C-NMR （150 MHz， pyridine-d5） δ ： 63.2 （C-1）， 71.0 （C-2），68.0 （C-3）， 173.3， 173.1 （C-1′， C-1″）， 34.3，34.1 （C-2′， 2″）， 25.1 （C-3′， 3″）， 30.0， 29.9，29.8， 29.6， 29.5， 29.4， 29.3， 29.2 （C-4″～14″，4′～14′）， 22.9， 22.8 （C-15′， 15″）， 14.3， 14.2（C-16′， 16″）， 105.7 （ C-1‴）， 72.2 （ C-2‴），75.2 （C-3‴）， 70.0 （C-4‴）， 77.1 （C-5‴）， 62.2（C-6‴）。该化合物经碱水解及GC-MS 分析证明酰基为十四碳酰基和十六碳酰基，二者比例1 ∶1。以上数据与文献 [14］基本一致，故鉴定为（2S） -1-O-十六碳酰基-2-O-十四碳酰基- 3-O-β-D-半乳糖基甘油。

化合物9：无色粉末状。 ESI-MS m／z： 493[M＋H］＋。1H-NMR （ 600 MHz， pyridine-d5） δ：5.65 （1H， m， H-2）， 5.48 （4H， m， H-6′， 7′，9′， 10′， 12′， 13′）， 4.78 （1H， d， J=7.7 Hz， H-1‴）， 4.66 （1H， dd， J = 3.0， 11.9 Hz， H-1a），4.53 （1H， d， J=3.3 Hz， H-4‴）， 4.49 （1H， dd，J= 5.3， 11.9 Hz， H-1b）， 4.41 （3H， m， H-2‴，6‴）， 4.33 （1H， dd， J = 5.3， 10.8 Hz， H-3a），4.11 （1H， dd， J = 3.3， 9.4 Hz， H-3‴）， 4.03（2H， m， H-5‴， H-3b）， 2.32 （2H， m， H-2′， 2″），2.08 （4H， m， H-8′， 14′）， 1.61 （4H， m， H-3′，3″）， 1.21 （24H， m， H-4′～15′）， 0.84 （3H， t，J=7.7 Hz， H-18′）；13C-NMR （150 MHz， pyridined5） δ： 63.2 （C-1）， 71.0 （C-2）， 68.0 （C-3），173.5， 173.1 （C-1′， C-1″）， 34.3， 34.1 （C-2′，2″）， 25.1 （C-3′， 3″）， 30.0， 29.9， 29.8， 29.6，29.5， 29.4， 29.3， 29.2 （C-4″～16″， 4′～7′， 16′），22.8 （C-17′， 17″）， 14.2 （C-18′， 18″）， 105.7（C-1‴）， 72.2 （C-2‴）， 75.2 （C-3‴）， 70.0 （C-4‴）， 77.1 （C-5‴）， 62.2 （C-6‴）。该化合物经碱水解及GC-MS 分析证明酰基为十四碳酰基和十六碳酰基，二者比例1 ∶1。以上数据与文献[15］基本一致，故鉴定为spongilipid。

化合物10：无色油状物。 EI-MS： m／z 93[M＋H］＋。1H-NMR （600 MHz， CD3OD） δ： 3.60（2H， dd， J=4.9， 11.3 Hz）， 3.53 （2H， dd， J=6.1， 11.3 Hz）， 3.67 （1H， m）；13C-NMR （150 MHz， CD3OD） δ： 62.3， 73.8。以上数据与文献[16］基本一致，故鉴定为丙三醇。

4 抑菌实验

将化合物4、 7 加无菌水分别制成0.1 mg／mL溶液，取适量与熔化的琼脂混匀，制成系列浓度含药琼脂平板，受试菌分别接种于含药平板上，测定化合物的最低抑菌浓度（平行3 次，用青霉素做对照）。结果，化合物4、 7 对金黄色葡萄球菌、黑曲霉菌、幽门螺旋杆菌有抑制作用，化合物4、 7 的MIC （最小抑菌浓度）分别为20、 30、 50 μg／mL，25、 50、 150 μg／mL；青霉素对黑曲霉菌无明显抑制作用，对金黄色葡萄球菌和幽门螺旋杆菌有抑制作用，其MIC 分别为0.4、 4.0 μg／mL。

5 讨论

糖脂类成分具有抗炎、抑菌、抗肿瘤等多种活性[13］，因其性质相似，分离比较困难。其结构研究的重点是C-2 构型、脂链结构、连接位置的确定，脂链结构常用的鉴定方法是碱水解，得到甘油糖苷和脂链，然后对脂链部分进行甲基化， GC／GC-MS 分析，鉴定脂链结构；脂链连接位置常用酶解法确认[14］；糖基部分可以采用酸水解的方法，得到的糖基再采用色谱或光谱分析鉴定[14］。因本研究所分离化合物均为已知成分，而且量较少，故未做酶解和酸水解。

传统理论认为，天南星具有豁痰作用，可有效治疗痰热壅肺之症，如气管炎、肺炎等病，而且这类疾病又常伴有细菌感染。本研究发现，化合物4、 7 具有抑制金黄色葡萄球菌、黑曲霉、幽门螺旋杆菌生长的作用，提示糖脂类成分可能是其活性物质之一。