木香顺气丸毛细管电泳指纹图谱研究

王玲娇 ，孙国祥，郑玉玲，杨继章，于 静△

（1.河北医科大学第一医院，河北 石家庄 050031； 2.沈阳药科大学药学院，辽宁 沈阳 110016）

木香顺气丸由木香、砂仁、香附（醋制）、槟榔、甘草、陈皮、厚朴（制）、枳壳（炒）、苍术（炒）和青皮（炒）等10味中药组方的中药复方，传统剂型为水丸［1］，具有行气导滞、燥湿健脾等功效，常用于治疗食积、腹痛、气郁等症［2］。药典中收载的质量标准为用高效液相色谱（HPLC）法测定厚朴酚含量，现有应用HPLC法建立的特征指纹图谱［3］和甲醇提取物的指纹图谱［4］，测定橙皮苷、厚朴酚、厚朴酚、木香烃内酯等制剂中单个或多个成分的含量［5-8］。文献 ［9-11］采用薄层色谱法定性鉴别木香顺气丸质量。毛细管电泳技术具有高效、快速、经济且易于清洗等优点［12-15］，目前已广泛应用于中药复方制剂的成分分析。本研究中针对不同电解质对色谱条件进行考察，建立了木香顺气丸的毛细管电泳指纹图谱（CEFP），并采用系统指纹定量法对其质量等级进行评价，为木香顺气丸的全面质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

HPCE-10S型高效毛细管电泳仪（大连江申分离技术科学公司）和自制重力进样装置，数据由江申色谱数据工作站记录；未涂层石英毛细管（河北永年光导纤维厂）；KQ-120D型超声波清洗器（宁波科生仪器厂）；Sartorius BS 110S型电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；KDM型控温电热套（山东鄄城华鲁仪器公司）；RE-52型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；PHS-3DC型精密数显酸度计（沪新科学仪器厂）；微孔滤膜（0.45 μm，上海兴亚净化材料厂）。

1.2 试药

乙腈（色谱纯，山东禹王实业有限公司）；橙皮苷对照品（hesperidin，HI，721-8601，供含量测定用，中国食品药品检定研究院）；硼砂、碳酸钠均为分析纯；所用水为去离子水；16批木香顺气丸（水丸）的批号及来源见表1。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

取橙皮苷对照品适量，精密称定，用运行缓冲溶液溶解，即得对照品溶液。取木香顺气丸约6 g，精密称定，加入50 mL 75%乙醇回流提取1.5 h，过滤，残渣加入50 mL 75%乙醇继续回流1 h，过滤，残渣再加入40 mL 95%乙醇再回流1h。合并3次滤液，减压浓缩至约10mL，然后用95%乙醇定容至25 mL，摇匀，作为供试品溶液，进样时用背景电解质（BGE）稀释1倍。

表1 16批木香顺气丸（水丸）的厂家和批号

2.2 毛细管电泳条件

色谱柱：石英毛细管柱（65 cm×75 μm，有效长度60 cm）；紫外检测波长：228 nm；灵敏度：0.005 AUFS；运行电压：11.0 kV；电流：110 mA；BGE：30 mmol／L 硼砂，100 mmol／L 碳酸钠（含 8% 乙腈）；重力进样：20 s；高度：8.5 cm。每次试验开始前用BGE冲洗毛细管柱5 min，再运行3 min后进样，试验结束后每天依次用0.1 mol／L NaOH 和水冲洗毛细管 10 min。为了提高电泳迁移时间的重复性，每进样5次后更新缓冲液。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：取橙皮苷对照品溶液和木香顺气丸供试品溶液适量，分别进样，记录电泳图，对比迁移时间可知5号峰为（迁移时间约为24.4 min）橙皮苷。在供试品溶液中加入橙皮苷对照品溶液，进样分析，结果电泳峰增益图也显示此峰为橙皮苷，色谱图见图1。因橙皮苷峰与相邻组分分离较好，且迁移时间适中，因此选作参照物峰。

精密度试验：取S1号供试品溶液，连续进样5次，以5号峰（橙皮苷峰）为参照，计算共有峰相对迁移时间的RSD均小于4.0%（n=5），相对峰面积的RSD均小于4.0%（n=5），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取S1号样品制备供试品溶液，分别于0，3，6，9，12 h 时进样测定，计算各共有峰相对迁移时间的RSD均小于3.0%（n=5），相对峰面积的RSD均小于4.0%（n=5），表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

图1 毛细管电泳图

重复性试验：取S1号样品制备供试液5份，进样检测，结果共有峰相对迁移时间的RSD均小于4.0%（n=5），相对峰面积的RSD均小于 4.0% （n=5），表明方法重复性良好。

2.4 木香顺气丸CEFP的建立

共有指纹峰的标定：按拟订电泳条件对16批供试品溶液在毛细管电泳仪上进样分析，记录电泳图，以各峰与参照物峰（橙皮苷峰）的相对迁移时间和相对峰面积标定其指纹特征，按峰出现率100%计，确定了14个共有指纹峰。参照物峰标号为5（S），其他共有峰依次为1，2，3，……，14。

木香顺气丸对照指纹图谱（RFP）的建立：将16批木香顺气丸毛细管电泳指纹图谱原始信号导入中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统3.0软件，按平均值法计算生成准对照指纹图谱，计算16批样品的宏定性、宏定量相似度值，以此值为变量建立木香顺气丸对照指纹图谱。

木香顺气丸高效毛细管电泳（HPCE）统一化指纹图谱：参考中药统一化色谱指纹图谱的创建方法［16］和统一化色谱指纹图谱相对统一化理论［17-18］，并发展了用25个数字化判据参数描述统一化色谱指纹图谱的相对统一化特征，可解决同一样品在不同检测仪器上得到的指纹图谱的比较评价问题。采用中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统3.0软件生成16批样品指纹图谱（S1-S16）及对照指纹图谱的统一化图谱，详见图2。对统一化指纹图谱进行评价，获得相对统一化判据参数，详见表 2。结果显示：1）指纹峰时间分布（rt_avg）在 0.6左右，说明指纹峰分布集中在图谱中部；ra_avg均小于0.5，说明多数指纹峰积分较小。2）峰等距性参数（α，α′，π），因 α＞0.5表明各指纹图谱峰等距性较好；峰后等距系数（α′）＜0.4，说明虚拟图谱峰等距性较差；前后等距系数比（π）以S7最大，其次是S3和S13较大，反映上述样品的指纹峰达到后等距较难。3）色谱指纹图谱定点指数（Fα／t）是rti=1时rai的扩展程度，其值越小越好，S5，S8，S10较小，表明其指纹图谱容易达到该理想状况。V=4.0～15.0，v=0.3～1，g=1.6～2.6，结果显示，不同批次药品色谱峰分布不是很均匀。4）色谱指纹图谱信号指数（Ft／a）从总体上反映各指纹峰rai=1时rti扩展程度的大小，其值越小越好，以S5最小，说明图谱达到理想状况最容易。b_avg=3.8～13，B=44.4～181.9，b_avg′=6.2 ～17.5，均表明各样品峰多数峰明显小于大峰，达到最大峰面积时较困难；扩展率（f）≥5.7，表明各成分含量分布差异较大；扩展比（p）=2.7～10.4，表明各峰积分信号均较大；两种指数比值（ξ）＞5.24，表明统一化指纹图谱较差。5）积分效率指数（E，ē，q）表明S15出峰最快，信号最大且积分速率最高；峰体大小指数（Λt，Λ）均较大，反映化合物成分较难被洗脱。6）色谱空间利用率（φ，%）代表色谱指纹图谱的空间利用效率，φ均小于0.45%，表明统一化指纹图谱的空间利用率很低。相对时间斜率因子（K）均较小，说明反应峰分散程度较小。其相关系数（r）代表了指纹出峰时间的均匀性，r越大，出峰越均匀。r＞0.9，说明色谱峰的分布均匀性一般。

图2 16批木香顺气丸统一化毛细管电脉指纹图谱

表2 木香顺气丸统一化特征判据参数

表3 系统指纹定量法评价木香顺气丸质量级别

2.5 系统定量法评价木香顺气丸质量

以对照指纹图谱为评价标准，采用系统指纹定量法［19-20］评价计算16批木香顺气丸的质量，判定其质量级别，结果见表2。若规定Sm≥0.75时样品化学成分数量和分布比例合格，结果仅S6，S10，S14不合格，其余各个批次均合格。若含量相似度（Pm）合格标准为60%≤Pm≤140% （α≤0.40），发现 S2，S9，S10，S12，S13，S14质量均因含量太高或太低而引起质量下降，其余批次产品均合格。

2.6 用聚类分析法评价木香顺气丸质量等级

以16批木香顺气丸建立对照指纹图谱得到的Sm和Pm为指标导入SPSS 13.0统计软件进行聚类分析。由图3可见，16批木香顺气丸的质量等级由于其宏定性、宏定量参数的2个不同方向出现了两大聚类，即S1，S3，S5，S7，S8，S10，S12，S14，S13 为一类，而 S2，S4，S6，S9，S11，S15，S16 为另一大类，2 个聚类的结果也表明质量等级的两端化差异决定了需要用16批木香顺气丸平均生成对照指纹图谱，以减少由于使用某一聚类生成对照指纹图谱造成的误差。

3 讨论

3.1 样品溶剂选择

供试品溶液浓度与BGE的离子强度有差异可能会对分离有影响，因此考察了供试品溶液直接进样和用BGE稀释1倍进样，结果发现供试品溶液浓度大时容易堵柱，证明离子强度的差异对不同浓度的供试品溶液有影响，故采取用BGE稀释1倍的方法进样。

3.2 BGE选择

本研究中曾考察不同电解质及不同pH的磷酸盐、硼酸、硼酸盐和硼酸盐-磷酸盐组成的BGE对电泳条件的影响，结果分离效果均不理想。查阅文献［21-23］，针对电解质一（30 mmol／L Na2B4O7，100 mmol／L Na2C2O3和 8% 乙腈），电解质二（15 mmol／L Na2B4O7，80 mmol／L硼 酸 和 50 mmol／L SDS），电 解 质 三 （30 mmol／L Na2B4O7，10 mmol／L Na2HPO4和 20% 乙腈 ），对电泳条件进行了选择。根据电泳谱图情况，选择电解质一，进一步考虑添加不同比例有机改性剂和调节pH进行再优化。

图3 16批木香顺气丸宏定性相似度聚类谱系

3.3 添加剂对分离的影响

在电解质一中加入不同浓度的甲醇、乙腈时，甲醇的加入使组分分离度增大，但峰展宽严重，且出现过多的峰拖尾现象，而当用乙腈时分离明显改善，加入不同比例的乙腈，最终试验确定用12%的乙腈；加入表面活性剂SDS、庚烷磺酸钠时使得基线噪音增大；当加入三乙胺后（可降低缓冲液黏度）色谱峰分离没有什么改善。用磷酸调节电解质一的pH，分离状态也未出现明显变化。对电解质一进行进一步优化，通过添加不同比例的乙腈和三乙胺、SDS及调节不同pH，比较各个电泳图谱，结果发现在 30 mmol／L Na2B4O7，100 mmol／L Na2C2O3和12%乙腈时电泳图谱最好，色谱峰基本分离。

3.4 分离电压影响

考察了电压 9，10，11，13，18 kV 的效果，发现电压低时基线稳定，但分析时间长，随着电压的增加，分析时间缩短，而且峰形变窄，分离度增大，但基线漂移严重，综合考虑最终选择了11 kV。