白花延龄草水提液对四氯化碳致小鼠肝纤维化的保护作用

王益富 ，姜 玮 ，刘 媛

（1.同济大学附属第十人民医院药学部，上海 200072； 2.江苏省泰州市食品药品检验所，江苏 泰州 225300；3.苏州大学附属第一医院药学部，江苏 苏州 215006）

当肝脏细胞外基质（ECM）的合成大于降解时，其在肝脏内会慢慢沉积，最终导致肝纤维化［1］。肝纤维化是慢性肝病的一个重要病理特征，也是肝硬化发生的重要环节，是慢性的病理过程。肝脏细胞外基质的主要形成细胞是肝星状细胞［2］。多种细胞因子与肝星状细胞的激活密切相关，目前已知肝星状细胞的最强丝裂原是血小板衍生生长因子。肝星状细胞是导致肝脏纤维化的主要细胞之一，在外界因素的刺激下如转化生长因子-β（TGF-β）、肝星状细胞转化为纤维细胞，进一步产生大量的细胞外基质蛋白，最终发生肝纤维化，通过抑制TGF-β对肝纤维化具有改善作用［3-6］。白花延龄草Trillium kamtschaticumPall.ex Pursh为百合科延龄草属植物，用于治疗高血压、失眠等疾病［7-10］。本研究中探讨白花延龄草水提液抗肝纤维化作用及其可能的作用机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与动物

仪器：FLUOstar Omega型全自动多功能酶标仪（德国 BMG Labtech公司）；Mini V-GES型垂直电泳槽（美国Wealtec公司）；LIOO JS-500型生物显微镜（北京京昊永成商贸有限公司）；Milli-Q Gradient A10型超纯水仪（美国Merck Millipore公司）；分析天平（天津市天马仪器厂）；TGL-16C型高速离心机（上海安亭科学仪器厂）。

试药：白花延龄草药材（批号为20170605）购自安徽亳州，经南京中医药大学药学院巢建国教授鉴定为白花延龄草Trillium camschatcenseKer Gawl.exPursh的干燥根茎，实验时加一定量蒸馏水煎煮，浓缩为1 g／mL的液体，冷藏，备用；扶正化瘀胶囊（上海黄海制药有限责任公司，批号为151040）；橄榄油（西班牙犀牛特级初榨橄榄油）；CCl4（分析纯，上海中试化工总公司，批号为20100030），临用前溶于橄榄油配成20%浓度的油液；天门冬酸氨基转氨酶（AST）、丙氨酸氨基转氨酶（ALT）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所。

动物：SPF 级 C57小鼠 50只，雄性，体质量（20±2）g，7周龄，购自南京市青龙山动物繁殖中心，动物合格证号为SZ（苏）20150002。饲养条件为房间温度24℃，相对湿度45% ～55%，小鼠正常饮水、喂食。所有实验均遵循南京中医药大学大学药学院动物实验规范和动物实验伦理。

1.2 方法

肝纤维化模型建立及给药：建立肝纤维化动物模型［11-14］。第 5 周开始，给予白花延龄草水提液 0.5 g ／kg（给药 A组）和 1 g／kg（给药 B组）及扶正化瘀胶囊（0.75 g ／kg，阳性对照组）进行干预 14 d，第 6 周实验结束后，麻醉小鼠，取肝脏及血液，用于后续分析。

血清学肝功能测定：取上述血液适量，先37℃条件下保温0.5 h，然后在4℃条件下静置2 h，离心10 min（2 000 r／min），将离心后的血清在-80℃保存，用于肝功能指标的检测。

肝脏组织SOD，MDA检测：将肝组织用生理盐水（1∶9）匀浆，根据试剂盒的说明，检测SOD和MDA水平。

苏木精 - 伊红（HE）染色：参考文献［11-14］，对肝组织进行固定，取材，乙醇梯度脱水，石蜡包埋切片，对小鼠肝组织作HE染色，观察纤维化程度。

蛋白质印迹（Western Blot）法：加裂解液收集肝脏组织裂解物总蛋白，组织蛋白行SDS-PAGE并转印至PVDF膜，常温下封闭2 h，与TGF-β一抗孵育，进一步进行二抗反应，发光试剂显影后用灰度成像软件测定条带的光密度值。

1.3 统计学处理

数据以表示，用 Graphpad Prism 5.0统计软件对多组比较行单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对血液AST及ALT的影响

与空白组相比，模型组血清中ALT和AST显著增高（P＜0.01）；与模型组相比，给药组肝脏血清中AST和ALT水平显著降低（P＜0.01）。详见图1。

图1 白花延龄草水提液对肝纤维化小鼠的肝功能生化指标的影响（X ± s，n=10）

2.2 对肝脏SOD及MDA的影响

与空白组相比，模型组小鼠肝脏中SOD显著降低，MDA显著增高（P＜0.01）；与模型组相比，给药组小鼠肝脏中SOD显著增高，MDA显著降低（P＜0.01）。详见图2。

2.3 肝脏病理损伤

空白组小鼠肝脏肝细胞均表现正常，肝细胞索排列较整齐，未见脂肪变性和纤维结缔组织增生，未见水样变性，未见形成假小叶，且枯否氏细胞也未见增生。毛细血管与汇管区内胆管均未见有胆汁淤积，汇管区未见纤维组织增生，未见炎性细胞浸润。模型组小鼠肝脏均可见炎性细胞浸润、肝细胞水样变性、坏死和脂肪变性。提示给药组能显著改善上述病理改变，结果见图3。

图2 白花延龄草水提液对肝纤维化小鼠肝脏SOD，MDA的影响（X ± s，n=10）

2.4 对TGF-β蛋白表达的影响

与空白组相比，模型组小鼠肝脏TGF-β蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比，给药组小鼠肝脏TGF-β蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。详见图4和图5。

3 讨论

医学检测的肝纤维化程度正是肝损伤的主要指标之一。肝纤维化属可逆性病变，由于肝纤维化模型简单、成功率高、死亡率低，故本试验选择通过注射CCl4造模。

脂质过氧化反应在肝纤维化形成过程中起重要作用，而SOD对机体的氧化与抗氧化平衡具有重要作用，MDA可反映过氧化反应的程度。本研究结果发现，白花延龄草水提液可明显降低MDA的量，提高SOD活性，提示白花延龄草水提液具有较强的抗氧化能力，抑制脂质过氧化反应是其抗肝纤维化的机制。

图3 白花延龄草水提液作用于肝纤维化小鼠的病理学变化（×200）

图4 白花延龄草水提液对TGF-β蛋白表达（蛋白电泳）的影响

图5 白花延龄草水提液对TGF-β蛋白表达的影响（X ± s，n=10）

肝纤维化大多是慢性肝损伤后，肝脏内以胶原为主的胞外基质过度沉积导致的。肝纤维化发生的中心环节主要是肝脏损伤-肝实质炎症、坏死-肝星状细胞，激活-大量细胞外基质沉积。TGF-β不仅可激活肝星状细胞，还可促进合成胶原，而肝星状细胞又是胞外基质的主要来源［15］，从而可能导致肝纤维化。本研究结果发现，白花延龄草水提液可显著降低TGF-β蛋白表达水平，是其抗肝纤维化的机制之一。

ALT和AST是肝脏病变程度的重要指标，广泛存在于肝脏细胞的细胞质中，肝脏病变或发炎时ALT和AST就会从肝细胞释放到血液中，显著提高ALT和AST水平。本研究结果显示，白花延龄草水提液能显著降低ALT和AST水平，对病症或炎性细胞组织有明显改善作用，是其抗肝纤维化的机制之一。

肝纤维化在中医理论上属气滞血瘀之病变［16］，白花延龄草具有祛风、舒肝、活血、止血功效，临床多用于肝病、高血压等病症。白花延龄草含有多种甾体皂苷和氨基酸类成分，故课题组选择以水为溶剂，加热回流提取浓缩后给药。本研究结果表明，白花延龄草水提液治疗肝纤维化疗效显著，可能与其所含活性成分密切相关，其中薯蓣皂苷元具有较强的抗炎功效，赖氨酸能促进新陈代谢，提高肝细胞活性。目前，关于白花延龄草相关药理活性研究较少，以后的研究中应加强活性成分的药理作用研究。