色谱实验室中高效液相色谱柱的管理

赵 明， 王安冬， 祝永卫， 郭梅芳， 杨金福

(北京工业大学 国有资产与实验室管理处，北京 100124)

高效液相色谱技术是一种高效能分离分析手段，现已广泛应用于药物[1]、食品[2]、环境[3]、材料[4]等方面的分析检测。在高效液相色谱分离系统中，担负着分离作用的色谱柱是整个色谱系统的核心，色谱柱的类型和效能决定了被分析物的类型和分离分析效果的好坏[5]。色谱柱的正确使用和维护管理十分重要，使用和维护不当将导致色谱柱柱效降低，进而缩短使用寿命甚至损坏。为使色谱柱能够充分有效地发挥其分离作用，同时形成科学有序的管理方法，提高实验室管理水平，本文从色谱柱的储存管理、使用管理以及维护管理三个角度出发，对色谱实验室中色谱柱的管理进行探讨和归纳。

1 色谱柱储存管理

1.1 色谱柱信息库的建立

对实验室内所有的色谱柱应按详细类型统一管理。建立色谱柱档案信息库[6-7]，信息库中需要收录的色谱柱信息应包括购置日期、购置途径、色谱柱品牌、型号、单价、填料、粒径、尺寸、耐受酸碱度范围、耐受温度范围、耐受压力范围、适用对象、保存方法以及注意事项等，并同时保存色谱柱包装内的说明书。

此外，建立每根色谱柱的使用档案。严格记录色谱柱的使用情况，需要记录的内容包括使用日期、使用者、流动相和样品信息、运行压力、运行时间以及是否出现特殊问题等，并将代表性色谱图保留。要求色谱柱使用者如实并及时登记使用情况，以便追溯并可掌握色谱柱状态，便于管理。

新购色谱柱与报废色谱柱都应及时做好记录备案。

1.2 色谱柱储存条件

每次使用色谱柱后需按照说明书的要求冲洗色谱柱，尤其是使用含有酸或盐成分的流动相时更需充分冲洗，最后将色谱柱保存在相应的溶液中(如一般C18色谱柱可保存至乙腈中)。卸下色谱柱后将两端用堵头拧好，放置色谱柱包装盒中，以免柱填料干裂或被污染。

设置色谱柱专用橱柜或储存在专用冰箱4 ℃冷藏室，按色谱柱类别分组放置，将色谱柱包装盒中标注信息的一端朝外。轻拿轻放，避免碰撞震动，保持储存环境避光、干燥，保持低温或室温。

2 色谱柱使用管理

2.1 正确选择色谱柱

选择合适的色谱柱是实现物质分离分析的前提。目前常用的色谱柱可根据色谱分离机制分为以下几种类型[8-9]，如表1所示。开展色谱实验时，根据实验目的、实验对象等正确、合理地选择色谱柱，一方面能够提高实验效率，取得正确可靠的实验结果，另一方面合理使用色谱柱也是对其功能的保护。

表1常见色谱柱分类

色谱柱类型分离原理适用对象填料反相色谱柱用键合非极性基团的载体填充而成的色谱柱,根据物质极性差异进行分离。固定相的极性小于流动相的极性。适用于大多数化合物,如蛋白质、肽、氨基酸、核酸、甾体、脂类、脂肪酸、糖类、生物碱等含有非极性基团的化合物。十八烷基硅烷键合硅胶(C18)、辛烷基硅烷键合硅胶(C8)、苯基键合硅胶等。正相色谱柱用硅胶或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱,根据物质极性差异进行分离。固定相的极性大于流动相的极性。(也可使用含水流动相,即HILIC)适用于非极性至中等极性的中小分子化合物的分离,如脂溶性维生素、甾体激素等。硅胶、氨基键合硅胶、氰基键合硅胶等。离子交换色谱柱以离子交换树脂或化学键合离子交换剂为固定相,利用被分离组分离子交换能力的差别或选择系数的差别而实现分离。适用于离子或可离解的化合物,如无机离子、有机酸、核苷酸、氨基酸、抗生素、蛋白质等。有机共聚物树脂、硅胶微球离子交换剂、螯合树脂等。分子排阻色谱柱根据凝胶孔隙的孔径大小与高分子样品分子的线团尺寸间的相对关系,对溶质进行分离。大分子的物质保留弱。用于分析多肽、蛋白质、核酸、多糖、聚乙烯、聚氯乙烯等。葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、高交联度苯乙烯-二乙烯基苯共聚物。手性拆分色谱柱由具有光学活性的单体,固定在硅胶或其他聚合物上制成手性固定相,通过引入手性环境使对映异构体间呈现物理特征的差异,从而实现光学异构体的拆分。光学异构体纤维素、环糊精、大环抗生素、蛋白质等。

2.2 规范实验耗材和试剂的使用

为避免色谱柱污染和堵塞，要求流动相均为色谱级别，并使用0.45 μm或更小孔径的滤膜滤过，尤其当流动相中含有缓冲盐时，过滤尤为重要。配制好的流动相使用前需超声排除液体内气体。

过滤时需注意区分微孔滤膜的水油系，水相需使用水系滤膜，有机相需使用油系滤膜，二者不可混用，以防止滤膜溶解而造成的污染，影响检测结果。

盛放流动相的容器和液相色谱仪器中的在线过滤器应定期清洗或更换，以避免容器污染和过滤器超载。

2.3 规范实验操作

在使用高效液相色谱仪进行实验时，应严格按规范操作，以使得色谱柱充分发挥分离作用。实验操作者，尤其是仪器管理人员，应养成正确的操作习惯。

安装色谱柱时注意系统流路的方向，色谱柱方向(柱身有箭头标注)应与系统流向保持一致。色谱柱一般情况下不可反冲。

实验前应选用适宜的流动相，注意流动相的pH范围应在说明书中标注的该色谱柱能够耐受的pH范围内，以免色谱柱中的固定相被破坏。

实验时避免过高的柱压，虽然高效液相色谱柱能够耐受的压力一般可达6 000 psi，但过高的压力或较大的压力变化会缩短色谱柱的使用寿命。在实验过程中，若出现柱压过高，则应该尽可能采取小流速，保持柱压不超过最大允许的压力的一半[10]。注意实验温度，一般色谱柱最高使用温度应不超过60 ℃，温度过高容易破坏柱内填料，降低柱效。

实验结束后要及时用合适的溶剂充分冲洗系统，一般使用20～30倍柱体积。最后根据说明书用相应的溶剂保存色谱柱。

2.4 加装保护柱

保护柱也叫做预柱，其作用是在流动相和样品进入色谱柱之前过滤掉其中的某些杂质和不溶物。尽管现在的高校液相色谱仪在流动相吸入滤头和进样阀后部都装有一定孔径的过滤器，但这种过滤器只能除去不溶性颗粒而无法除去化学污染物，因此在分析成分复杂的混合物或需要大量进样时，加装保护柱是必不可少的措施。选择保护柱时，保护柱的填料应与分析柱保持一致。

3 色谱柱维护管理

3.1 定期测定色谱柱柱效

随着色谱柱使用时长增加和分离样品数量的增多，其柱效(即色谱柱分离能力)可能有所降低，为保证实验结果的可靠性并及时掌握色谱柱状态，应定期对色谱柱的柱效进行考查和评价。新购置色谱柱的说明书中附有该色谱柱的柱效和柱效测定方法，一般采用尿嘧啶、邻苯二甲酸二甲酯、硝基苯、萘等物质作配置混合标准品，考查经色谱柱分离的分离度，计算理论塔板数，得到柱效值[11]。每次测定柱效后应详细记录本次柱效测定的时间、所用标准品、结果(理论塔板数、分离度、对称因子等)、色谱图、测定者等信息。定期测定柱效方便掌握色谱柱的状态和使用情况，评价色谱柱的性能变化。理论塔板数是反映色谱柱的关键参数，一般当理论塔板数下降50%时可认定该色谱柱已无法满足正常的分离需要，应及时对其进行再生处理。

3.2 色谱柱的故障处理

(1) 缓冲盐堵塞色谱柱。如果流动相中含有缓冲盐，在色谱柱中遇到高浓度有机试剂易导致盐析出，形成结晶，导致色谱柱堵塞，柱压升高。此时可用10%甲醇/水冲洗色谱柱，使色谱柱内的盐全部溶解，再逐步换到高浓度甲醇继续冲洗。

(2) 色谱柱进气泡。仪器运行时流动相跑空、流动相用前未超声排尽气泡以及仪器用前未排尽管路内气泡等情况均可导致色谱柱进入气泡。色谱柱进入气泡的表现是柱压不稳。此时可先排空管路中气泡之后，使用大比例有机相以小流速如0.2 mL/min长时间冲洗，直至柱压稳定，色谱柱排气泡时建议后续不连接检测器，以免将气泡冲进检测器。

(3) 色谱柱被污染。 柱头筛板污染堵塞，此时色谱图可表现为拖尾(不对称)，柱压升高，在这种情况下应反向连接柱子，使用小流速高浓度有机相冲洗柱子(以C18柱为例)；或将柱头螺丝拧下，取出柱头过滤筛板，将其置于30%所有稀硝酸内超声清洗10 min，再用纯水超声清洗10 min左右，重新装入色谱柱即可。色谱柱内污染，由样品的沉积引起的污染的C18柱，可用能溶解污染物的流动相反向冲柱，冲洗量一般为20～30倍柱体积。

(4) 色谱柱再生。当色谱柱柱效较低无法正常使用时，可尝试色谱柱再生。下面介绍几种常用色谱柱的再生方法[12]。

反相柱的再生：可用90%甲醇、纯甲醇和二氯甲烷等有机溶剂顺次冲洗色谱柱，再用相反顺序冲洗一遍。每次冲洗量为20～30倍柱体积。

正相柱的再生：可用正己烷、异丙醇、正己烷、甲醇作为流动相顺次冲洗色谱柱，再用相反顺序冲洗一遍。每次冲洗量为20～30倍柱体积。注意溶剂需要完全脱水。

离子交换柱的再生：阳离子柱可使用稀酸缓冲液冲洗，阴离子柱可使用稀碱缓冲溶液冲洗。

以上方法并非绝对，可根据色谱柱的实际使用情况，选择能够较好溶解柱内污染物的溶剂进行冲洗，但需要注意的是，再生色谱柱不可能完全恢复色谱柱柱效。色谱柱再生后需做好记录，方便管理。

3.3 色谱柱的报废

如果色谱柱柱效太低且无法维修和再生，应由管理员标记，做好停用记录，报废处理，不可随意丢弃。

4 结语

色谱柱的有效管理能够提高利用率，充分发挥其使用价值并可延长使用寿命，同时也能在实验室中形成有序的实验氛围，促使实验人员养成科学严谨的实验素养，提高实验室管理水平。本文按照逻辑顺序以色谱实验室中色谱柱的储存管理、使用管理、维护管理三个方面讨论归纳了色谱柱管理方法和具体措施，以期能够实现对色谱柱的高效全面管理。